このプロジェクトの支援と支援のためのクリス·ガイ、ジェイソン·デル·リオに感謝します。この作品は、RO1 SPGへの助成金GM070676によってサポートされていました。

ハエの株は、ラボで購入して増幅することができる。受信されたショウジョウバエ培養バイアルの量に応じて、一つは頻繁に一度バイアルが最大容量に達しており、文化バイアルを&quot;反転&quot;する必要があります。約50 ショウジョウバエの培養瓶がいっぱいになるまで増幅が続行されます。一つは、その後（カップ意思フライ次のセクションで説明されています）100ミリリットルビーカートライコーンで &quot;カップを飛ぶ&quot;ことができます。 24時間後に、下部に貼付し、フライ食品と種子新しいショウジョウバエ培養バイアルにこれらのカップから胚を使用しています。室温で一晩胚から完全に成長してハエにショウジョウバエの胚の成長時間は約8.5日です。シードの胚は、最初の幼虫のステージに12から15時間後に孵化。幼虫は孵化後24および48時間で2番目と3番目の幼虫ステージに二回脱皮約4日間、成長します。幼虫はその後pupariumsにカプセル化し、tから新興国まで、4日間の変態に提出する相続人蛹ケース1。各ハエの量を増加させるショウジョウバエ培養バイアルに約2〜3日間以上の成長を可能にします。 400バイアルが満たされている場合、50産卵カップ（カップあたり約1,000雌バエ）のハエのに十分な量が存在します。ハエは、新しい環境に適応する時間が必要です。これは通常のカップに転送された後、コレクションの準備ができている彼らのために二日ほどかかります。毎日の寒天プレートを交換するハエは長生きすることができている、フライカップをきれいに維持されます。 （ ショウジョウバエのケアと増幅のさらなる理解のために、DBロバーツ&quot; ショウジョウバエを参照してください：実践的アプローチ2）。 ショウジョウバエの胚を大量に取得するには良い情報源は、市販されている人口ケージ3です。人口ケージの組み立てとメンテナンスは本ショウジョウバエの第5章と7日に見ることができます：P細胞および分子生物学4 ractical用途。しかし、人口のケージは高価であり、維持することは困難です。人口ケージは、ハエの豊富な量を保持できるので、二酸化炭素の使用は、ハエを転送し、供給する必要があります。前に述べたように、二酸化炭素も出さないよう、それらを引き起こして、ハエの健康を減少させます。小さな規模で、100ミリリットルトライコーンのビーカーを使用することができます。 50 100mlのビーカーに、dechorionated胚の9グラムを達成することができます。ために我々は、異なるメッシュサイズのダブルレイヤーふるいキャッチャーを作成している死んだハエ、未使用の酵母ペーストと他の不純物を除去します。死んだハエのようなものふるいトラップが不要な材料の胚は（350ミクロンの孔径）を通過することができた。第二部では、 ショウジョウバエの胚および他の不純物を捕捉することを意味するメッシュ（120ミクロンの孔の大きさ）、メッシュを通過しますが含まれています。 1。カップの準備と胚コレクションを飛ぶ<ol><li>フリップ複数のバイアルから空のプラスチックバイアルに増幅されたハエは、ハエの量まで、バイアルの高さの1インチに達しています。その後、100ミリリットル卵コレクションカップ（ナイロンメッシュ窓付きtriconビーカー）にそれらのハエを転送します。ハエを転送するときにハエの脱出を防ぐために、硬い表面の上にカップをタップしてください。寒天プレート含む酵母ペーストでカップをカバーし、安定化時間の24〜48時間が可能になります。 </li><li> 50フライカップから一晩寒天プレートを収集し、水をきれいにペイントブラシを使用して実行しているふるいキャッチャーにプレートの内容を洗う。肉はすべて酵母ペーストは、多量の水でふるいに胚を洗い流されるまで。 </li><li> 3分間、50％の漂白剤でそれらを浸漬して洗浄し、胚をDechorionate。 </li><li>胚漂白剤の臭いルーズまで幅広く蒸留水で洗い流してください。その後、AC倍タオルを複数回にそれを置くことによって、胚でメッシュを乾燥させます。クリーンバイアルに胚を移し、重量を記録します。 &lt;/ LI&gt; </ol> 2。胚の均質化、清澄化<ol><li>氷冷抽出緩衝液の1.5倍のボリュームでダウンスホモジナイザーでdechorionated胚を配置します。 </li><li>緩い乳棒で5ストロークを行います。クリーンな遠心チューブに分注しホモジネートを。 40分間15,000 gで遠心します。 4℃で</li><li>慎重に上部の白い脂質層または下部ペレットせずに上澄み液を収集します。 </li><li> 30分50,000 gで遠心チューブと遠心分離機をきれいに上清を移します。 4℃で</li><li>上記で説明したように収集した結果、高速上清を直ちに使用することができるか月間凍結し、-80℃で保存スナップすることができます。 </li></ol> 3。微小管重合とキネシンの結合<ol><li>室温に凍結した高速な上清を解凍します。 、微小管を重合させるGTP（0.3 mm）とタキソール（20μM）を追加し、20分間室温で穏やかに攪拌する回転シ​​ェーカー。 </li><li>キネシンをバインドするには、回転シェーカーで、室温で10分間撹拌し、続いて2.5 mMの非加水分解性ATPアナログの5&#39;-アデニル酸imidodiphosphate（AMPPNP）を追加します。 </li></ol> 4。微小管とキネシンの差動沈降<ol><li> 30分間、23000グラム（sw41tiローター、TLS-55）で遠心分離によって等量の蔗糖クッション（抽出緩衝液に20％スクロースおよび10μMのタキソール）を介して堆積物。 4℃で</li><li> 10μMのタキソール、75 mM NaClを含む抽出緩衝液の元のホモジネート量の10％で再懸濁によってペレットを洗浄します。 </li><li>ステップ4.1のような別の等量の蔗糖クッションと沈降を繰り返します。 </li><li> 20μMタキソール、75mMのNaCl、10mMのMgSO 4を 、10 mMのATPと5％の抽出緩衝液中で塩洗浄からペレットを再懸濁する。 </li><li> 4時20分℃で12万グラム（42,000回転：31000回転、TLS-55 sw41tiローター）での堆積物上清（キネシンを収集する画分）。 </li><li> 4℃で15分間、14,000 gで遠心ろ過℃を実行します。濃縮されたサンプルを回収し、30分間上記のように、新しいフィルタとろ過を繰り返し、濃縮サンプルを収集します。 </li><li>濃度を決定するタンパク質アッセイを実行します。簡単に言えば、既知のタンパク質の濃度を変化させること（ウシ血清アルブミン、BSA）ブラッドフォード試薬の既知の体積と混合し、波長595nmにおける光学密度を測定した。その後、光学密度対濃度の標準曲線は、標準のBSAのサンプルと同様の条件下で測定し、このサンプルの光学密度を用いたキネシン画分を精製した未知の濃度を計算するために設立されました。ゲル電気泳動と同様にウェスタンブロット法はまた、精製したキネシンの既知量を用いて行った。 </li><li>液体窒素中で所望の濃度とスナップ凍結の小さなボリュームにアリコートキネシン画分は-80℃で保存する℃、 </li></ol>フルレングスの機能キネシンは、 ショウジョウバエの胚から精製した。 図1は、精製過程の異なる画分を示す銀染色ゲルを示しています。レーン1、レーン2は明確化した後にペレットのサンプルを解明した後、高速上清（ステップ2.5）のサンプルです、レーン3、レーン4ショ糖クッション（ステップ4.1）を持つ最初沈殿後の上澄み液のサンプルを示します。ペレットのサンプルが最初に沈降した後、レーン5は、第2沈降（ステップ4.3）後の上清のサンプルになっている場合、レーン6は、第2の沈降後ペレットのサンプル、レーン7は、ペレットのサンプルです。最終沈殿（ステップ4.5）、レーン8は、精製されたキネシンのサンプル、レーン9は、フィルタリングキネシンのサンプルであり、レーン10は、マーカーである。レーン8および9で濃縮されたバンドは115前後でKDはFigurと一致しているキネシン重鎖1です。E 1、1988年5公開サクストン紙のレーン8。 図2は、精製したキネシン画分のCウエスタンブロットを表すには、キネシン重鎖抗体を用いて検出されました。抗体AKINO1-著しく他のキ ​​ネシンファミリーのメンバー6で交差しません。画分をキネシン-1に濃縮されている間、注意してその機能キネシンの良い情報源で、このプロトコルの結果が、潜在的に他のキネシンや他のモータータンパク質を含む可能性の汚染物質が存在します。我々は、ろ過によってより小さい汚染物質の様々を削除しました。限り単独でのサイズによって行うことができない他のモータを取り外すと、精製はキネシン7を研究するために他のユーザーによって行われたものと同様であり、我々は、アクティブなモーターの大半は、キネシン-1であると信じていますが、より洗練された精製ができるようになるなどの潜在的なモータの汚染物質の除去はCole ら 8サクストンらによって行われた9。 </p&gt; 10 &quot;モータータンパク質の運動アッセイ&quot;と題したスコーリーの本で詳しく説明したようにキネシンの能力（processivity）は、in vitroで単一分子の微小管結合アッセイにより評価した。簡単に言うと、単一のアクティブモータとポリスチレンビーズは、飽和（1 mm）のATPの存在下で、微小管と接触させた。モーターは微小管に取り付けられており、レーザートラップの中心から離れて歩き始めた。トラップの中心部からはビーズの事前定義された変位（100 nm）でレーザービームのパワーは、自動的にモータが無負荷の下でMTに沿って歩くことができ、オフにした。映画は、MTに沿って歩いて、単一のキネシンとビーズ500nmの直径を示しています。ビデオ画面の長さは20μmに対応しています。 図3は、ここで紹介するプロトコールに従って精製し、単一のフルレングスショウジョウバエのキネシン分子のためのランタイムの長さの測定分布を表します。 exponentiらは、ディストリビューションに適合すると、単一のキネシン1.55平均レングス±0.1μmと1.28±それぞれフィルタとフィルタ処理されていないサンプルの0.12μmを提供します。 <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig1.jpg" alt="図1" /> 図1は、精製画分の銀染色ゲル：サンプルそれぞれの画分からは、10％ゲルで実行されています。タンパク質10μgを各レーンにロードされました。レーン1、レーン2は明確化した後にペレットのサンプルを解明した後、高速上清（ステップ2.5）のサンプルです、レーン3、レーン4ショ糖クッション（ステップ4.1）を持つ最初沈殿後の上澄み液のサンプルを示します。ペレットのサンプルが最初に沈降した後、レーン5は、第2沈降（ステップ4.3）後の上清のサンプルになっている場合、レーン6は、第2の沈降後ペレットのサンプル、レーン7は、ペレットのサンプルです。最終沈殿（ステップ4.5）、レーン8は、精製されたキネシンであるサンプル、レーン9は、100 kDのカットオフアミコンウルトラ0.5ミリリットル遠心フィルター（Millipore、米国）を使用してフィルタリングキネシンです。青い矢印は、その金額は減少し、赤の矢印は、このプロトコルで使用される遠心濾過工程によるキネシンの濃度を示したタンパク質を示す。 <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig2.jpg" alt="図2" /> 一次抗体に対する精製したキネシンのサンプルはゲル電気泳動に供し、（ニトロセルロース膜で）ブロットしたAKINO1·インキュベーション、続いて室温で1時間（TBSTで1:1000）： 図2精製KHC画分は抗キネシン抗体に対してブロットした。室温で1時間のためにロバ抗ウサギ抗体（TBSTで1:10,000）であった。 ECL（化学発光）キットは、上記のようにキネシン信号を検出するために使用された。 <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。 </strong単一のショウジョウバエ全長キネシンの&gt;ランレングスと速度（A）と（B）フィルタキネシンサンプルのランレングスと速度。 （C）と（D）フィルタ処理されていないキネシンサンプルのランレングスと速度。 図4。キネシンの運動のビデオは<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3501/3501movie4.avi" target="_blank">ビデオを見るにはここをクリック</a> 。

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	<li>Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+culture+of+Drosophila+2A.">The laboratory culture of Drosophila 2A.</a> The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , (1998).</li><li>Kunert, N., Brehm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+Drosophila+Embryosand+Chromatographic+Purification+of+Native+Protein+Complexes.">Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).</li><li>Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+kinesin:+Characterization+of+microtubule+motility+and+ATPase.">Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).</li><li>Shubeita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1098 (2008).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+Velocity+Measured+for+Single+Kinesin+Molecules.">Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules.</a> Cell. 77, 773 (1994).</li><li>Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"Slow"+Homotetrameric+Kinesin-related+Motor+Protein+Purified+from+Drosophila+embryos.">A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos.</a> J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microtuble+Motor+Proteins.">Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins.</a> Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).</li><li>Scholey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+Assay+for+Motor+Proteins.">Motility Assay for Motor Proteins.</a> Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).</li><li>Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+kinesin+from+bovine+brain+and+assay+of+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).</li><li>Aizawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Family+in+Murine+Nerwous+System.">Kinesin Family in Murine Nerwous System.</a> The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+dynein+tail+mutation+impairs+motor+processivity.">A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity.</a> Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

マウス脳は同様に12使用されているものの、ウシの脳は、フルレングスキネシンを精製するために最も広く使用されている出発材料11である。キネシン源としてウシの脳を使用しての大規模な欠点は、新鮮な原料の可用性です。屠殺場は、通常アクセスできないと、脳はアクティブキネシンを得るために非常に新鮮でなければなりません。さらに、若い牛の脳だけが有効であ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や材料の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>寒天（顆粒） </td><td>フィッシャー</td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td>デキストロース（D-グルコース）を無水</td><td>フィッシャー</td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>ベクトン</td><td> 35 1007 </td><td> 60x15mmスタイル （ポリエステル）20/bag </td></tr><tr><td> ショウジョウバエ培養バイアル</td><td> UCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td>トライコーンのビーカー</td><td>エコノ研究所（株） </td><td> B700-100 </td><td>容量：100ミリリットル、 サイズ：58x72mm </td></tr><tr><td>酵母</td><td>赤色星</td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ</td><td> Genesse科学</td><td> 57から102 </td><td> 120メートルicron孔サイズ</td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ</td><td>スモールパーツ</td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td>パイプ</td><td>シグマ</td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td>パイプ</td><td>シグマ</td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td>シグマ</td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4（無水） </td><td>フィッシャー</td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td>シグマ</td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>シグマ</td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> APROT応仁の乱</td><td>シグマ</td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> TAME </td><td>シグマ</td><td> 178403から8 </td><td></td></tr><tr><td> STI </td><td>カルビオケム</td><td> 65635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td>シグマ</td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td>タクソール</td><td>シグマ</td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATPアナログの5&#39;-アデニル酸imidodiphosphate </td><td>シグマ</td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td>マリンクロット</td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td>シグマ</td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ遠心フィルタ：0.5 mLを、100kDのカットオフ、8本パック</td><td>ミリポア</td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and purification of kinesin from drosophila embryos

モータータンパク質は微小管に沿って貨物を移動し、特定のサブ携帯の場所にそれらを運ぶ。変更されたトランスポートが微小管に基づいてモータの輸送とその調節を理解し、神経変性疾患の様々な根底にあることが示唆されているため、おそらく最終的に改良された治療法につながる。キネシン-1はATPの加水分解により微小管の電源（MTS）に沿って順行性（プラス端）方向に移動する真核生物のモータータンパク質である。ここでは、このように、単一分子生物物理学の研究とショウジョウバエの遺伝学の組み合わせを可能にする、 ショウジョウバエの胚からアクティブな完全な長さのキネシンを分離するための詳細な精製プロトコールを報告します。カップ当たり約1000人の女性で、約50敷設カップを皮切りに、我々は一晩のコレクションを行った。これは、パックされた胚の約10ミリリットルを提供した。胚（胚の約9グラムが得られる）dechorionated漂白剤であったし、ホモジナイズした。 AFTERの中断は、ホモジネートを高速遠心分離に続いて低速のスピンを用いて明らかにした。明らかに上清は、MTSを重合させるGTPおよびタキソールで処理した。キネシンは、ATPアナログ、室温で5&#39;-アデニル酸imidodiphosphateを追加することにより、重合MTの上に固定化されました。キネシンの結合した後、微小管は、ショ糖クッションを介して高速遠心分離を介して沈殿させた。微小ペレットを再懸濁し、このプロセスが繰り返されました。最後に、ATPはMTSからキネシンを解放するために追加されました。高速遠心分離し上清中にキネシンを残して、MTをスピンダウン。このキネシンは、さらに精製するためにフィルタ100 KDカットオフを使用して遠心濾過し、分注し、液体窒素中で凍結し、-80℃で保存されているにスナップブロッティングSDSゲル電気泳動とウェスタン精製サンプルを用いて行った。最後の遠心濾過工程の前と後精製したサンプルの運動in vitroで単一分子の微小管のアッセイで用いて評価した。遠心濾過前と後のキネシン分画は、以前に文献で報告されているように（processivity）を示した。さらに実験では、キネシンやその他の輸送関連タンパク質間の相互作用を評価するために進行中です。

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Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

これからアクティブ全長キネシンを分離するためのプロトコルです。<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;単一分子生物物理学の研究のための胚。我々は、胚を収集する胚溶解液を作成し、その微小管（MTS）を重合する方法を示しています。キネシンは、MTSでそれを固定するキネシン-MT複合体をスピンダウンし、ATPの添加によってMTSからキネシンを解放することによって精製される。

キネシンの単離及び精製からショウジョウバエ胚

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

isolation-and-purification-of-kinesin-from-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

12.1K ビュー.  University of California, Irvine. これからアクティブ全長キネシンを分離するためのプロトコルです。ショウジョウバエ単一分子生物物理学の研究のための胚。我々は、胚を収集する胚溶解液を作成し、その微小管（MTS）を重合する方法を示しています。キネシンは、MTSでそれを固定するキネシン-MT複合体をスピンダウンし、ATPの添加によってMTSからキネシンを解放すること?...

ビデオ: Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

生物学

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

の単離と精製ショウジョウバエ</em磁気ビーズソート別>末梢ニューロン

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

ショウジョウバエの胚の生体内の遠心

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

の直立イメージングショウジョウバエ胚

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

から初代細胞培養ショウジョウバエ原腸胚

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

転写産物および代謝物からの精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ヘッド

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

のレア細胞集団からのTRAP-RC、翻訳リボソームアフィニティー精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

Methods Article

キネシンの単離及び精製からショウジョウバエ胚