Ex Vivo Calcium Imaging of Flat-Mounted Rat Retina upon Electrical Stimulation

GCaMP 5G発現ラット網膜をMEAに装着し、GCLを顕微鏡ステージ上の電極に向けます。灌流システムを接続し、サンプルバスを酸素化AMS培地で常に灌流するようにパラメータを設定します。次に、蛍光灯、FITCフィルター、CMOSカメラを取り付けた倒立蛍光顕微鏡で網膜を検査します。

刺激電極とGCaMP発現細胞からの蛍光が見える領域を探します。パルス発生器のソフトウェアで、パルスの形状、振幅、持続時間、位相遅延、周波数などの電気刺激パラメータを設定します。出力トリガー信号を使用してカメラをパルス発生器に接続し、カメラソフトウェアのキャプチャモードを外部開始トリガーに設定します。

カメラソフトウェアのスタートボタンを押して、外部トリガーが起動するのを待ちます。パルス発生器ソフトウェアを使用して画像取得プロセスを開始し、キャプチャした画像を保存して、ファイル名に適用されたすべての電気刺激パラメータが含まれていることを確認します。次に、イメージ J を開き、領域選択ツールを使用して関心領域をセグメント化し、ROI マネージャーに追加して、ROI マネージャー メニューを使用して zip フォルダーとして保存します。

セル soma から平均グレー値を抽出するには、[more] に移動して [multi measure] をクリックします。600 個のスライスをすべて測定し、スライスごとに 1 行のオプションを有効にして、列が ROI に対応し、行が時間枠に対応する 1 つのテーブルを取得します。次に、measure コマンドを使用して ROI から重心を抽出します。

写真の漂白効果を補正し、背景を最小限に抑えるには、各バースト前の非刺激間隔から約15〜20フレームを選択し、これらのフレームを線形曲線に合わせて、最適なデータ分析を確保します。60秒間の画像取得中に10秒ごとにパルストレインを5回バーストしたときの細胞体のカルシウム痕跡が示されています。非刺激期のフレームは、写真の漂白効果を補正するために使用されます。

細胞を活性化するのに必要な電流と刺激電極からの距離の関係は、刺激電極に近い位置にある細胞が応答を誘発するためにより低い電流値を必要とすることを示しました。