Bacterial Extracellular Vesicles (BEVs) Enrichment from Human Faeces Using Differential Centrifugation Speeds

まず、準備したヒトの糞便サンプルを採取します。高速冷蔵遠心分離機を摂氏4度に冷却します。PBS を使用してサンプルチューブの重量を 0.1 グラムに調整し、3 、 000 G で摂氏 4 度で 20 分間遠心分離します。

プラスチックピペットを使用して、上清を2本の50ミリリットルチューブに移し、1ミリリットルを残します。次に、上清を12, 000Gで4°Cで30分間遠心分離します。20ミリリットルのシリンジを使用して、上清を吸引し、注射器から針を取り外します。

0.22マイクロメートルフィルターで液体をろ過し、50ミリリットルのチューブに入れます。次に、バケツを75%アルコールで拭いて、残っている汚染を取り除きます。ろ過した糞便上清の約30ミリリットルを超遠心チューブに移します。

チューブの開口部から3ミリメートルの隙間を残して、約8ミリリットルのPBSをチューブに充填します。2本の超遠心チューブを対向する超遠心分離バケットに入れ、PBSを使用して2つのバケットの重量を均等にします。チューブが装填されているかどうかに関係なく、すべてのバケットをローターにロードします。

サンプルを遠心分離機に入れ、真空を開始し、160 、 000 G で 70 分間、摂氏 4 度で回転させます。遠心分離が完了したらすぐに、チャンバーの真空を解除し、超遠心分離機のドアを開きます。その後、すぐにローターを取り外します。

バケットをローターからラックに移し、ニッパーを使用してチューブをピックアップします。上澄みを捨て、目に見える茶色のペレットを保存します。1ミリリットルの冷やしたPBSを加えて、ペレットを完全に再懸濁します。

チューブに約37ミリリットルのPBSを充填し、開口部から3ミリメートルの隙間を残します。超遠心分離をもう一回行った後、上清を廃棄し、チューブを5分間反転させたままにします。内壁に残っている溶液をワイパーで取り除きます。

1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、1.2ミリリットルの冷やしたPBSを加えてペレットを再懸濁し、ピペッティングで混合します。1.2 ミリリットルの PBS BEV 溶液を 1 本の超遠心チューブから清潔な 1.5 ミリリットルのマイクロチューブに移します。