まず、手袋、カートリッジ、培養プレートを70%エタノールで洗浄して無菌状態を維持します。次に、バイオプリンターのコンプレッサーをオンにし、初期化ボタンを選択してプリンターを初期化します。プリンター内部の表面を70%エタノールで拭き取ります。
「印刷実行」ボタンを使用して、印刷ファイルをロードし、印刷プロトコル PDF を開きます。バイオインク、アクチベーター液、および50ミリリットルの完全培地を室温で解凍します。印刷プロトコルのPDFの指示に従って印刷カートリッジを準備し、指定されたコンパートメントに正しい量の試薬があることを確認します。
次に、C1にF3を1.2ミリリットル、C2にF32を1.2ミリリットル、C2にF261を200マイクロリットル加える。ポリエチレンイミンとラミニンでコーティングされたプレートをインキュベーターから取り外します。プレートホルダーコンパートメントをロープロファイルプレートに設定します。プリンタの右側のプレートホルダーコンパートメントにプレートを挿入します。
プレートから蓋を外し、蓋ホルダーに入れます。プリントカートリッジをバイオプリンターに挿入し、[不活性ベース印刷]ボタンを選択して印刷実行を開始します。融解後、グルタミン酸作動性ニューロンおよびアストロサイトを遠心分離し、上清を吸引し、1ミリリットルの完全な培地に両方の細胞タイプを別々に再懸濁します。
20マイクロリットルの細胞懸濁液を同量のトリパンブルーと混合し、細胞をカウントして、各細胞タイプの生細胞濃度を決定します。次に、300万個のグルタミン酸作動性ニューロンと100万個のアストロサイトを15ミリリットルのチューブで結合し、完全な培地を加えて最終容量を8ミリリットルにします。細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を吸引します。
ピペッティングで上下させて、200マイクロリットルの活性剤液F299にペレットを懸濁させます。カートリッジと培養プレートに蓋を置き、バイオプリンターから取り外します。バイオセーフティキャビネットで、200マイクロリットルの細胞懸濁液をプリントカートリッジのウェルC3に加えます。
カートリッジをバイオプリンターに再挿入し、前述のように蓋を取り外します。印刷実行の印刷モデル・ステージを開始します。同時に、2Dコントロールプレートのラミネートメディアを完全なメディアと交換します。
バイオプリンティングターゲティングプレートをバイオプリンターに挿入し、蓋を取り外します。バイオプリントのターゲティングプロセスを開始します。プロンプトが表示されたら、バイオプリンターからターゲットプレートを取り外します。
ガイドを使用して、プレート上で液滴が観察できる場所を特定します。ターゲティングプレートをバイオプリンターに再挿入し、液滴の印刷と選択のプロセスを繰り返します。プロンプトが表示されたら、ターゲティングプレートを細胞培養プレートと交換します。
プリント後、すべての3D共培養ウェルに完全な培地を添加し、摂氏37度、二酸化炭素5%でインキュベートします。最後に、カートリッジと残りの液体を廃棄します。ラボプロトコルによる。
7日間の印刷後、単一の細胞はほとんど残っておらず、神経突起と星状細胞突起の相互接続束が強化されているように見えました。神経突起伸長は12時間から156時間の間に直線的に増加した。神経突起伸長の間、細胞体クラスターもサイズが大きくなりました。
細胞生存率解析では、全細胞の約72%が4日目に生きており、29%が死んでいることが示されました。免疫染色により、バイオプリントされたニューロンとアストロサイトの健康な細胞形態が確認され、どちらの細胞タイプも細胞突起の伸長を示しました。ニューロンのグルタミン酸作動性表現型は、グルタミン酸受容体2の免疫染色によって確認されました。
