Preparation of Electrocompetent Agrobacterium tumefaciens Culture for Microalgal Genetic Engineering

まず、アグロバクテリウム・ツメファシエンス培養液の0.5マイクロリットルを50ミリリットルのオートクレーブ超純水で希釈します。この希釈培養液を10マイクロリットル、溶解ブロスまたはLBプレート上に広げます。プレートを摂氏28〜30度で1〜3日間インキュベートします。

次に、リファンピシンを添加した20ミリリットルのLB培地に単一のコロニーを接種します。培養物を摂氏28〜30度で一晩インキュベートします。翌日、シェーカーフラスコに500ミリリットルのプレーンLB培地に9ミリリットルの一晩培養液を接種します。

培養液を摂氏28〜30度のシェーカーに置きます。インキュベーションして培養物をチューブに分割した後、冷やしたチューブを摂氏4度、4, 000 Gで15分間遠心分離します。ピペットを使用して上清を取り除き、各ペレットを50ミリリットルの氷冷水に再懸濁します。

遠心分離して上清を廃棄した後、ペレットを各チューブ内の25ミリリットルの氷冷水に再懸濁します。前と同じように遠心分離し、ペレットを1ミリリットルの氷冷10%グリセロールに再懸濁します。次に、遠心分離する前に、すべてのチューブの内容物を1本の50ミリリットルチューブに結合します。

最後に、上清を廃棄した後、ペレットを400マイクロリットルの氷冷グリセロールに再懸濁します。