まず、0.5ミリリットルの尋常性クロレラの対数相培養液をピペッティングします。Tris-Acetate-PhosphateまたはTAP寒天培地で培養液を広げます。摂氏25度で5日間培養します。
次に、10ミリリットルの添加LBブロスに、シェーカーフラスコ内でエレクトロポレーションしたアグロバクテリウム・ツメファシエンス培養液を充填したループを接種します。フラスコを摂氏28〜30度、250RPMで一晩インキュベートします。翌日、1ミリリットルの一晩培養液を50ミリリットルの補充LBに接種する。フラスコを摂氏28〜30度、250RPMでインキュベートします。
藻類とバクテリアの培養を共培養する。まず、アグロバクテリウム培養液を50ミリリットルのチューブに移します。チューブを室温で 4 , 000 G で 30 分間遠心分離します。
次に、上清をピペットで取り出して廃棄し、誘導培地を使用して細胞を2回洗浄します。次に、25ミリリットルの誘導培地を尋常性クロレラ培養プレートに添加します。細胞を50ミリリットルのチューブに移し、室温で15分間、4, 000 Gで遠心分離します。
上澄み液を処分した後、藻類細胞ペレットを200マイクロリットルの細菌懸濁液と混ぜ合わせます。21〜25°Cのロータリーインキュベーターで複合培養物を振とうし、150RPMで1時間振とうする。200マイクロリットルの混合培養液を誘導培地プレートに広げ、15ミリモルのグルコースを添加し、プレートを摂氏21〜25度の暗所で3日間インキュベートします。
3日後、10ミリリットルのTAP培地を使用して微細藻類をフラスコに集めます。テトラサイクリン1リットルあたり20ミリグラムを補給する。フラスコを暗闇で2日間インキュベートし、温度を摂氏21〜25度に保ちます。
500マイクロリットルの培養液を選択培地にプレーティングし、1リットルあたり20ミリグラムのテトラサイクリンを添加します。プレートを暗闇で摂氏21〜25度で2日間インキュベートしてから、照明付きのチャンバーに移します。形質転換プレートから単一コロニーを選択し、TAP寒天プレートにストリークします。
コロニーPCRを行うには、まず、少量の形質転換藻類細胞を10マイクロリットルの滅菌水に加えます。溶液を摂氏98度で15分間沸騰させます。同様に、サンプル中のアグロバクテリウムの存在を確認するために、別のPCRテンプレートを処理します。
はしごでDNAアガロースゲル上でPCRサンプルを流し、得られたフラグメントのサイズを確認します。形質転換されたコロニーは、セフォタキシムを含むハイグロマイシンを含むプレート上で増殖することができました。野生型のコロニーはプレート上では成長しませんでした。
セフォタキシム1リットル当たり最大70ミリグラムの耐性を有するコロニーが得られた。pCAMBIA1302のコロニーPCRアンプリコンは藻類サンプルには存在しなかった。しかし、アンプリコン中のMGFP5Gは、3つの藻類サンプルすべてで検出されました。
セフォタキシムの継代培養を繰り返した藻類培養物は、プラスミドの不在を示す病原性タンパク質E2の不在を示しました。形質転換体と野生型株の藻類の生育に有意な差が観察された。増殖が低かったにもかかわらず、形質転換体は細胞密度を正規化すると蛍光レベルが高かった。
