Dual-Reporter IgG and IgM Serological Assay for Simultaneous Antibody Detection of Borrelia

96ウェルプレートで5マイクロリットルの血清サンプルと120マイクロリットルのアッセイバッファーを混合して、ヒト血清サンプルの希釈を開始します。10マイクロリットルの初期希釈液と70マイクロリットルのアッセイバッファーを混合して、さらに8倍に希釈します。次に、標的抗原共役ビーズを含む100マイクロリットルのビーズミックスを調製します。

次に、調製したビーズミックスをファルコンチューブ内のアッセイバッファー2.4ミリリットルで希釈します。25マイクロリットルのビーズ懸濁液を指定されたウェルにピペッティングして、血清インキュベーションを開始します。25マイクロリットルの200倍希釈血清をビーズ懸濁液とともにウェルに加えます。

96ウェル反応プレートをマイクロプレートシールで覆います。次に、プレートシェーカーでビーズでプレートをインキュベートします。インキュベーション後、プレートシェーカーから96ウェル反応プレートを取り出します。

プレートを磁気プレートワッシャーに入れ、粘着プレートシールをはがします。次に、100マイクロリットルの洗浄緩衝液でビーズを3回洗浄し、最後の洗浄ステップの後にビーズから最終洗浄量を吸引します。最初の抗体インキュベーションでは、まず、アッセイバッファー中で新しいIgGとIgMのデュアル検出試薬混合物を調製します。

30マイクロリットルの検出試薬を指定された各ウェルにピペットで移し、96ウェル反応プレートをマイクロプレートシールで覆います。プレートシェーカーでプレートを20°C、毎分750回転で45分間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを磁気プレートワッシャーに入れ、前と同様にプレートを洗浄した後、30マイクロリットルの希釈BV421標識ストリップタビジンを各反応ウェルに付着プレートシールピペットから取り出します。

次に、密封されたプレートをプレートシェーカーに置き、その後のインキュベーションを行います。インキュベーションが完了したら、プレートを洗浄し、洗浄バッファーを使用してウェル内のビーズを最終容量の100マイクロリットルに再懸濁します。結果を解析するには、96ウェル反応プレートをマイクロプレートシールで覆います。

次に、蓋をしたプレートをプレートシェーカーで20°C、毎分1000回転で3分間インキュベートします。プレートをシェーカーからデュアルレポーターフローアナライザー装置に移します。最後に、メーカーの指示に従って、サンプルの蛍光強度中央値(MFI)を評価します。

3つの代表的なボレリア抗原のスピアマン相関解析により、ヒト血清中に存在する抗ボレリア抗体を検出した場合、MFI値の均一な再現性が実証されました。デュアルレポーターアッセイは、アッセイ間の再現性が良好で、アッセイ間の精度も高く、Levey-Jenningsチャートで実証されました。サンプル希釈倍率を 100 倍から 12、800 倍にすると、IgM 検出と IgG 検出の両方の希釈曲線は両装置で類似していました。

MFI値は、単一のレポーター機器でわずかに高くなっています。