Surface Plasmon Resonance (SPR) for Evaluating PROTACS-Induced Ternary Complex Formation

VHL-MZ1相互作用のSPRを実行するには、まずメーカーの指示に従ってストレプトアビジンチップを活性化します 最高濃度にするには、MZ1にDMSOフリーのバッファーを添加して、DMSO濃度を2%にします。次に、50マイクロリットルの最高濃度溶液を100マイクロリットルのランニングバッファーを含むウェルにピペットで移します。よく混ぜて、2番目に高い濃度を設定します。

次に、50マイクロリットルの溶液を次の100マイクロリットルのランニングバッファーに移し、よく混合して3番目に高い濃度を調製します。プレートを覆うには、ポリプロピレン製マイクロプレートと互換性のある粘着性の透明プラスチックホイルを使用してください。マルチサイクルセットアップを使用してSPRを開始します。

モードを高性能に設定し、接触時間を120秒、解離時間を300秒、流量を毎分50マイクロリットルに設定します。機器メーカーが提供する評価ソフトウェアを使用して、データ解析を実行します。VHL-MZ1-BRD4三元複合体のSPRを行うには、まずストレプトアビジンを活性化します。

VHL溶液を注入して、約100共鳴単位に固定化します。BRD4のみを使用したネガティブコントロールでは、200マイクロリットルの容量のランニングバッファーに最高濃度の25マイクロモルを調製します。次の4つのウェルに、それぞれ160マイクロリットルの2マイクロモルBRD4を追加します。

ウェルA5からA4に40マイクロリットルを移します。次に、ウェルをピペットで動かして完全に混合します。同様に、40マイクロリットルをウェルA4からA3に移し、A1に達するまでこのプロセスを続けます。MZ1 および BRD4 による三元複合体形成の場合は、196 マイクロリットルの 25.5 マイクロモルの BRD4 溶液をピペットで取り出します。これに、100%DMSO溶液で調製した20マイクロモルMZ1を4マイクロリットル加える。

160マイクロリットルのBRD4を2マイクロモルのランニングバッファーにピペットで移し、左側の次の4つのウェルに移します。次に、ウェルB5からB4に40マイクロリットルを移し、ピペットで完全に混合します。B1まで各ウェルから溶液を移し続けます。次に、接触時間100秒、解離時間720秒、流速50マイクロリットル/分のシングルサイクルセットアップでSPRを実行します。

VHL-MZ1二元錯体とVHL-MZ1-BRD4三元複合体の特性評価を行った。肯定的な協調性が観察されました。大脳、PROTAC、およびPPM1Dシステムの特性評価はSPRによって行われました。

PPM1D実験ではニッケルNTAチップを使用し、化合物注入のたびにチップ表面が再生されます。BRD-2512はセレブロンにのみ結合し、BRD-4761はPPM1Dにのみ結合し、結合応答はごくわずかです。BRD-5110は、PPM1D間に三元複合体の形成を誘導し、高濃度の化合物でフック効果を示します。