Constructing the 3D Human-Stem-Cell-Derived In Vitro Blood Brain Barrier

解離した内皮細胞、寄生虫、アストロサイトを使用して、ヒト多能性幹細胞由来の血液脳関門(iBBB)を組み立て、3種類の細胞を円錐形のチューブに組み合わせ、ピペッティングエラーを考慮して計算された細胞数よりも10%多く含めます。細胞混合物を300gで3分間スピンダウンします。上清を吸引し、細胞ペレットに約50マイクロリットルの培地を残します。

P200ピペットを使用して、細胞ペレットを残留培地に静かに再懸濁し、単一細胞スラリーを作製します。得られた細胞スラリーの入ったチューブを氷上に置き、必要な数のiBBBごとに十分な量の還元GF基底膜マトリックスを添加します。気泡を混入させず、細胞を均一に混合します。

得られた細胞マトリックス混合物50マイクロリットルを48ウェルまたは96ウェルのガラス底培養皿のウェルにピペットで移し、皿の底全体に均等に分配します。ディッシュを摂氏37度で30〜40分間インキュベートし、細胞をカプセル化しながらマトリックスを重合します。最後に、500マイクロリットルの添加アストロサイト培地をウェルに加え、iBBBを培養中に維持します。

96ウェルプレートの場合、100〜150マイクロリットルの培地を、通常2週間かかるダウンストリームアッセイ用に十分に発達するまでウェルに加えます。適切に形成されたiBBBは、明視野顕微鏡下で固まった単一の半透明の円盤として現れました。24時間後、均等に分布した単一細胞が同定された。

2週間後、定義は難しいものの、より明瞭な構造が見えてきました。