Purification of Human Solute Carriers (SLCs) for Developing SLC Targeting Therapies

まず、凍結溶質担体またはSLC細胞ペレットを室温の水浴中で解凍します。135ミリリットルの塩基性緩衝液と3種類のプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤を組み合わせて、可溶化緩衝液を調製します。錠剤が溶解したら、ペレットを可溶化緩衝液に再懸濁します。

次に、デアミナーゼを添加し、懸濁液を氷冷ホモジナイザーに移します。プランジャーを約20回上下に動かし、ホモジナイザーを氷上に保持して溶液を均質化します。次に、界面活性剤原液を最終濃度1%に添加します。

可溶化混合物を50ミリリットルの円錐形チューブに移し、摂氏4度でゆっくりと回転させます。1時間後、混合物を遠心分離し、上清を回収する。4〜6ミリリットルのストレプタクチン樹脂をベースバッファーで平衡化します。

次に、可溶化した上澄み液に平衡樹脂を加え、摂氏4度で2時間回転させます。溶液を重力流柱に注ぎ、溶液が流れるようにします。Strep Wash Buffer(溶連菌洗浄バッファー)のベッド容量の30倍のレジンを3等分して洗浄します。

次に、3〜5ミリリットルの錯覚緩衝液を添加し、15分間インキュベートしてから溶出物を回収します。紫外線吸収分光法によりタンパク質濃度を測定します。目的の錯視画分を組み合わせ、3Cプロテアーゼを添加します。

チューブを摂氏4度で一晩ゆっくりと回転させます。翌日、2〜4ミリリットルのコバルト金属アフィニティー樹脂をSECバッファーで平衡化します。平衡化したコバルト金属アフィニティー樹脂を一晩の3C反応混合物に加え、摂氏4度で回転させます。

1時間後、溶液を重力流塔に注ぎ、流れを回収します。100キロダルトンのカットオフ遠心フィルターで、摂氏4度で3000gで回転させ、フロースルーを濃縮します。平衡化デキストランアルゴスベースの SEC カラムと SEC バッファー。

サンプルをサンプルループに注入し、カラム圧力がカラムメーカーの仕様を下回る流量で SEC プログラムを実行します。フラクションコレクターを使用して、SEC 分析全体で 300 マイクロリットルのフラクションを回収します。ピークフラクションをプールした後、280ナノメートルで吸光度を測定します。

次に、100キロダルトンのカットオフフィルターでサンプルを必要な量に濃縮します。初期の小規模SLCタンパク質発現をSDSページ電気泳動で分析した。GFPタグ付きSLCの蛍光顕微鏡検査により、細胞内に著しい蓄積を伴う細胞膜に特異的なタンパク質の局在が確認されました。

化学的および構造的に均質なタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー中に単一の単分散 A280 ピークを生成しました。