まず、0.01%ジギトニンを含む2ミリリットルの氷冷核溶解バッファーをグラスDounceに充填し、解剖したマウス脳組織片をその中に加えます。ガラス製のDounce組織ホモジナイザーを使用して、乳棒AおよびBで組織をそれぞれ25回均質化し、得られたホモジネートを15ミリリットルのチューブに移します。0.01%ジギトニンを含む2ミリリットルの氷冷核溶解バッファーをホモジネートに加え、氷上で5分間インキュベートします。
次に、核を500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。マイクロピペットを使用して上清を除去し、0.01%ジギトニンを含む4ミリリットルの氷冷核溶解バッファーを添加します。核懸濁液を40マイクロメートルのセルストレーナーでろ過します。
核を再び遠心分離し、上清を除去し、4ミリリットルの染色バッファーを加えて核を洗浄します。懸濁液を40マイクロメートルのセルストレーナーでろ過した後、遠心分離により核をペレット化し、0.04%BSAおよびRNase阻害剤を含む1ミリリットルのPBSに核を再懸濁します。細胞を数えるには、0.5ミリリットルのチューブで10マイクロリットルの0.4%トリパンブルーと10マイクロリットルの核を混合します。
自動セルカウンターを使用して核をカウントします。100マイクロリットルの核をFACSチューブに移し、未染色コントロールを行います。残りの核に10マイクロリットルの7-AADを加え、摂氏4度で5分間インキュベートし、FACSを用いて核選別を進めます。
次に、選別した核10マイクロリットルを、2%熱不活化FBSを含む90マイクロリットルのDPBSを含む新しいFACSチューブに移します。選別した核を遠心分離した後、マイクロピペットを使用して上清を除去し、100マイクロリットルの希釈核バッファーに核を再懸濁します。選別前のサンプルには、99%以上のシングレットが核染色に陽性であり、効果的な細胞溶解を示すかなりの破片が含まれています。
選別後の脳核は、純度が当初の36%からほぼ100%に増加した
