まず、マウスの骨髄造血幹細胞と前駆細胞が入ったバイアルを服用します。マイクロピペットを使用して、ペレットを1ミリリットルのACK溶解バッファーに再懸濁し、室温で1〜2分間インキュベートします。再懸濁した混合物を、あらかじめ湿潤させた70マイクロメートルのセルストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに移します。
次に、10 ミリリットルの FACS バッファーを添加して、ACK 溶解バッファーを希釈します。混合物を400 G、摂氏4度で5分間遠心分離し、最初に1ミリリットルの緩衝液に再懸濁し、次に9ミリリットルの緩衝液を補充することにより、ペレットを10ミリリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。次に、0.5ミリリットルのチューブに10マイクロリットルの0.4%トリパンブルーと10マイクロリットルの細胞を混合し、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。
細胞を染色するには、細胞を400 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。ペレットを1ミリリットルの緩衝液に再懸濁し、次に残りの容量を補充することにより、ペレットをFACS緩衝液に再懸濁し、10倍の最終濃度を10倍にして1ミリリットルあたり7細胞にします。P1000マイクロピペットを使用して、懸濁液を35マイクロメートルのセルストレーナーキャップを通してFACSチューブに移します。
次に、下図のように染色ミックスを調製します。遠心分離後、細胞懸濁液を300マイクロリットルの染色ミックス1に再懸濁し、サンプルチューブに入れ、光から保護した氷上で15分間インキュベートします。次に、300マイクロリットルのミックス2をサンプルチューブに加え、光から保護された氷上で20分間インキュベートします。
3 ミリリットルの FACS バッファーを、単一の染色および混合染色したサンプルチューブに加えます。次に、細胞懸濁液を遠心分離します。上清を廃棄した後、ペレットを500マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。
500マイクロリットルの収集培地を事前に充填した1.5ミリリットルのチューブを準備します。FACS装置のキャリブレーションが完了したら、500マイクロリットルのFACSバッファーを細胞懸濁液に加え、1ミリリットルのサンプルを35マイクロメートルのセルストレーナーキャップを通して新しいFACSチューブに移します。細胞選別後、選別した細胞10マイクロリットルを、90マイクロリットルのFACSバッファーが入った新しいFACSチューブに移します。
遠心分離により細胞懸濁液をペレット化し、0.04%BSAを含む50マイクロリットルのPBSに再懸濁します。懸濁液を0.2ミリリットルのチューブに移し、BSAを含む50マイクロリットルのPBSを元のチューブに加えて、残った細胞を回収します。細胞を0.2ミリリットルのチューブに移し、総容量100マイクロリットルにします。
パイロット実験を実施して、核単離に最適な溶解時間を特定します。核をペレット化した後、核ペレットを12マイクロリットルの希釈核緩衝液に再懸濁します。0.4%トリパンブルーと0.04%BSAを含むPBS8マイクロリットルのチューブに2マイクロリットルの核を加え、自動セルカウンターを使用して核をカウントします。
核の単離が完了したら、6マイクロリットルの核再懸濁液を、150マイクロリットルのFACSバッファーをあらかじめ充填した新しいFACSチューブに移します。3マイクロリットルの7-AADを加え、氷上で5分間インキュベートします。
