Mesenchymal Stem Cell Sample Preparation, Flow Cytometric Analysis, and Cell Sorting

まず、2 つの新しい FAX チューブに Mixed Tube 1 と Mixed Tube 2 のラベルを付けます。フローサイトメトリー解析のために、所定の表に従って細胞および抗体懸濁液を調製します。チューブを30分間インキュベートした後、各チューブを1ミリリットルの染色バッファーで2回洗浄します。

ボルテックスチューブを室温で200 Gで10分間遠心分離します。次に、ペレットを500マイクロリットルの染色緩衝液に再懸濁します。48ウェルプレートのウェルを200〜500マイクロリットルのFBSでコーティングし、1時間保持します。

次に、残留FBSを除去した後、200〜500マイクロリットルの10%MSC培地をピペットで移します。シングルセルソーティング用のサンプルを調製するには、1ミリリットルのFBSを2つの新しいファックスチューブにピペットで移します。チューブを転がして、チューブの内面にFBSを均一にコーティングします。

細胞と抗体の懸濁液を混合チューブ1と2に、表のように調製し、選別実験を行います。その後、チューブを暗所で室温で30分間インキュベートします。染色緩衝液で洗浄した後、チューブを室温で200 Gで10分間遠心分離します。

次に、ペレットを500マイクロリットルの染色緩衝液に再懸濁し、5マイクロリットルのDAPI中で15分間インキュベートしてから選別します。補正マトリックスを設定するには、シングルステイン補正チューブを使用します。装置ソフトウェアのツールバーから実験をクリックします。

次に、報酬設定をクリックし、続いて報酬コントロールを作成します。次に、未染色チューブをクリックし、サイトメーターのダイアログボックスでパラメーターをクリックします。各パラメータの値を編集して電圧を調整します。

取得ダッシュボードで [load] をクリックし、[acquire] をクリックします。P-1ゲートをセル集団にドラッグし、すべての補正コントロールに適用して、各パラメータの電圧と負のゲートを設定します。次に、単一の汚れ補正チューブを個別にロードします。

データを記録して保存します。現在の実験を選択して右クリックし、 [補正値の計算] を選択し、 [リンク] と [保存] を選択します。混合チューブを1つ動かし、10, 000個の細胞を記録します。

適切なゲート戦略で並べ替える対象母集団のゲートを設定します。次に、コレクションプレートを装置にロードし、ウェルあたり 2, 500 から 5, 000 セルの範囲の目標セル番号を設定します。次に、シングルセルソート純度マスクを選択します。

選別した細胞集団を回収装置に集め、選別実験の間、氷上に保管します。最後に、プレートを5%二酸化炭素インキュベーターに移し、培養を摂氏37度に維持します。マルチパラメトリックフローサイトメトリーアッセイプロットでは、CD 90 FITC抗体のFITCアイソタイプの発現は示されませんでした。

マーカーCD-90およびCD-73の陽性発現およびCD-45の陰性発現は、それらの未染色およびFMOコントロールの発現に匹敵します。免疫表現型は、ISCT推奨マーカーとCD-44を含む初期の継代の1つからのマーカー分布を示し、親集団をMSCとして決定しました。後期継代シェッドは、高発現者と薄暗い発現者の単一細胞選別に使用されました。

48ウェルプレートで収集されたポストソート細胞は、親集団と同様に接着と増殖を示しました。ポストソートされた細胞は、脂肪生成成長因子の存在下で分化しました。