免疫蛍光染色によって辺縁ニッチ細胞またはLNCを同定するには、5%マトリゲルコーティングされた6ウェルプレートで培養したLNCに、ウェルあたり1ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAを添加します。プレートを摂氏37度で5分間インキュベートして細胞を消化します。MESCMを含むノックアウト血清1ミリリットルを細胞懸濁液に添加して消化を急冷します。
細胞懸濁液を遠心チューブに移し、200Gで5分間遠心分離してから、上清を慎重に吸引します。ペレットを1ミリリットルのMESCMに再懸濁します。次に、細胞分離機を使用して、メーカーの指示に従って、80マイクロリットルの細胞懸濁液を4枚の顕微鏡スライドに均等に堆積させます。
細胞を4%パラホルムアルデヒドで約10分間固定します。次に、0.2%Triton X-100 in PBS を使用してスライド上の細胞を 15 分間透過処理します。2%ウシ血清アルブミンで細胞を1時間ブロックした後、摂氏4度のシェーカーで一次抗体と一晩インキュベートします。
インキュベーション後、スライドをPBSTで3回、それぞれ5分間洗浄して、結合していない抗体を除去します。次に、サンプルを適切な二次抗体と摂氏37度で1時間インキュベートしてから、前述のように未結合抗体を洗浄します。1ミリリットルあたり5マイクログラムの濃度のDAPIで核を対比染色します。
スライドを密封した後、蛍光顕微鏡を用いてイメージングを行う。RNA単離キットを使用して、メーカーの指示に従ってLNCからトータルRNAを抽出します。次に、大容量の相補的DNAまたはCDNA転写キットを使用して、1〜2マイクログラムのRNAを逆転写します。
2.5マイクロリットルのCDNA、0.8マイクロリットルの対応する遺伝子プライマー、10マイクロリットルのユニバーサルPCRマスターミックス、および6.7マイクロリットルの二重蒸留水を含む20マイクロリットルの溶液を調製します。次に、適切な条件を用いて定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行います。最後に、比較CT技術を用いて、相対的な遺伝子発現を調べます。
第4継代LNCの二重免疫染色により、これらの細胞は一貫してpanCK陰性、VIM陽性、CD90陽性、CD105陽性、SCF陽性、およびPDGFR陽性であることが明確に明らかになりました。
