ヒト胎盤由来の小さな細胞外小胞をマウスに注入してBBB破壊を研究

マウスへの小さな細胞外小胞またはSEV注入を行うには、低酸素および正常酸素条件下で培養したヒト胎盤外植片から単離されたSEVを使用します。200マイクログラムの胎盤SEVをpH 7.4のリン酸緩衝液中で、最終容量70マイクロリットルまで希釈します。注射の前に、RMCBSスケールを使用して動物の健康状態を評価します。

次に、30ゲージの針を備えたインスリン注射器を使用して、適切に麻酔されたマウスの外頸静脈に溶液を注入します。注入後、乾いた綿棒で注入部位に15秒間軽く圧力をかけます。注射後 3、6、12、および 24 時間で RMCBS スケールを使用してマウスの健康状態を評価します。

エバンスブルーの血管外漏出を分析するには、PBSに2%エバンスブルー色素溶液を調製します。眼窩後アクセスを使用して SEV を注入してから 24 時間後に、適切に麻酔をかけられたマウスに Evans Blue 溶液を注入します。エバンスブルーが動物の体内に循環したら、麻酔をかけたマウスに約3ミリリットルの生理食塩水で心臓内灌流を行い、循環から色素を除去します。

BBSに4%パラホルムアルデヒドの心臓内注入でマウスを固定し、脳を慎重に抽出した後、体重を量り、写真を撮ります。実証された手順に従って、各グループの動物から脳を抽出します。実体ズーム顕微鏡を使用して、解剖した脳スライスのキャプチャ画像を視覚化します。

キャプチャした画像を使用して、ImageJ ソフトウェアを使用してエバンスブルーの血管外漏出を定量化します。正常酸素胎盤からSEVを注射したマウスとは対照的に、低酸素胎盤からSEVを注射したマウスは、注射後24時間まで神経学的スコアの漸進的な低下を示した。低酸素胎盤からSEVを注射したマウスの脳は、正常酸素胎盤からSEVを注射した動物の脳よりもエバンスブルーの血管外漏出が高かった。

低酸素胎盤からSEVを注射したマウスの脳では、血液脳関門の圧迫に重要なCLDN5タンパク質の量が減少しました。これらの結果はすべて、低酸素胎盤からのSEVによって導入された血液脳関門の破壊を示しました。