まず、10%FBSおよび5%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むDMEM完全培地で6ウェルプレートで細胞を培養します。培養液を摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。翌日、細胞を10ナノモルのポリリジン変性酸化鉄ナノ粒子またはIONPで共培養し、摂氏37度、二酸化炭素5%で12時間インキュベートします。
インキュベーション後、ウェルあたり0.5ミリリットルのトリプシンを3分間添加して細胞を消化します。次に、ウェルごとに1ミリリットルの完全培地を追加して、消化を停止します。細胞懸濁液を 1, 000 g で 5 分間遠心分離し、上清を捨ててからペレットを PBS に再懸濁します。
次に、ペレットを8ミリリットルの新しく調製した高張溶液に15分間再懸濁します。細胞懸濁液をガラス試験管に移し、ガラスホモジナイザーを使用して、1, 000 RPMで20回のショックを与えて細胞小器官を放出します。ホモジナイズ後、1ミリリットルの細胞懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
チューブを磁気分離器に1時間入れて、IONP負荷エンドソームを他の細胞小器官や細胞破片から完全に分離します。エンドソームを回収するには、チューブから液体を捨て、3ミリリットルのPBSを加えてエンドソームを再懸濁します。次に、ピペットガンを使用してブローし、磁気フレームの隣のチューブの接触面にある茶色のペレットを再懸濁させます。
高速ホモジナイズのために、エンドソーム溶液を15ミリリットルの遠心チューブに移します。アイスボックスをチューブの下に置き、チューブを高速ホモジナイザーに置きます。10ミリリットルのプローブを底に触れずにチューブに入れます。
ホモジナイザーの画面で、速度を 140 g に調整し、時間を 5 分に設定します。OKボタンを押してから、スタートボタンを押します。高速ホモジナイズ後、ナノベシクル懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移し、チューブを磁気セパレーターに1時間入れます。
最後に、必要なエキソソーム模倣体またはEMを含む液体を、磁気フレームの隣の表面を乱すことなく回収します。NTAおよびTEMで解析したBMSC-EMの形態は、脂質二重層で区切られた典型的なお椀状の小胞状構造を示しました。BMSC-EMと293T-EMは、どちらもネイティブEVと同様の流体力学的直径を持っていました。
ウェスタンブロッティングの結果、BMSC-EMはEVと同じタンパク質バイオマーカーを含み、細胞膜の汚染がほとんどないことが示されました。EMSの収率は、超遠心分離法で調製されたネイティブEVよりも有意に高かった。EMのタンパク質組成は、ネイティブEVと似ていました。
