まず、PBSを灌流した斬首マウスの脊髄を取り除きます。脊髄を冷たいDPBSに浸し、氷上のペトリ皿に入れます。18ゲージの針と冷たいDPBSで満たされた10ミリリットルのシリンジを使用して、油圧押出を使用して、層流フードで脊髄全体を分離します。
脊椎をペトリ皿に移し、冷たいDPBSを保冷剤の上に置いた。層流フード内の顕微鏡を使用して、鋭利な鉗子で目に見える髄膜を慎重に取り除きます。次に、脊髄を空のシャーレに移し、No.10外科用メスの刃を使用して、脊髄を2〜3ミリの長さのセクションに切断します。
脊髄細胞の酵素解離のために、酵素ミックス1と2を脊髄片に加えます。皿の中で酵素を数回渦巻かせて、脊髄が均一にコーティングされるようにします。皿を摂氏37度で30分間インキュベートし、10分ごとに皿を手動で回転させます。
インキュベーション後、350マイクロリットルのDNAse I.Swrollを皿に静かに回して混ぜます。次に、0.5%FBSを添加した1ミリリットルの冷DMEMを加えてから、穏やかに混合します。すぐに内容物全体を5ミリリットルのチューブに移します。
P1000ピペットを使用して、組織を3回静かにトリチュレーションします。次に、プラグを差し込んだ9インチのガラス製パスツールピペットを使用して、組織をさらに5回穏やかにトリチュレーションします。チューブを30秒間直立させて、組織を落ち着かせます。
P1000ピペットで上清を吸引し、30マイクロメートルのフィルターを通して15ミリリットルのコニカルチューブに移します。残りの組織が入ったチューブに、FBSを添加したDMEMを1ミリリットル加えます。その後、パスツールピペットで3回静かにトリチュレーションします。
組織を底に沈殿させた後、上澄み液を30マイクロメートルのフィルターに通し、先ほど使用したのと同じ15ミリリットルのチューブに集めます。ろ過した細胞懸濁液を300gで室温で10分間遠心分離します。真空吸引器を使用して、上清を慎重に廃棄します。
成人脳解離キットに付属の破片除去溶液を使用して、細胞ペレットからミエリンを除去します。次に、5ミリリットルのFBS添加DMEMをペレットに加え、チューブを3回静かに反転させて混合します。遠心分離後、上清を廃棄し、細胞ペレットを1ミリリットルのFBS添加DPBSに再懸濁します。
上澄みを廃棄する前に、再度遠心分離します。メーカーのプロトコルに従って、細胞を抗ACSA-2 MicroBeadsで標識しました。磁気分離カラムを使用して、ポジティブ選択によって細胞を分離します。
次に、細胞を300gで10分間遠心分離してから、上清を廃棄します。次に、細胞ペレットを1ミリリットルの温かいFBS添加DMEMに再懸濁します。細胞懸濁液を血球計算盤に移し、細胞をカウントし、その生存率を評価します。
FBS DMEMで細胞濃度を75, 000細胞/50マイクロリットルに調整します。次に、50マイクロリットルの細胞懸濁液を24ウェルプレート内のポリ-l-リジンでコーティングされたカバーガラスに移します。プレートを摂氏37度で2時間インキュベートし、細胞がカバーガラスに付着するようにします。
次に、450マイクロリットルの温かい抗生物質を添加したFBS DMEMを各ウェルに慎重に加えます。ミクログリアとアストロサイトの単離と増殖の成功が観察されました。4日目までに、アストロサイトはより長い突起を形成することが観察され、より短い紡錘体を持つ楕円形のミクログリア細胞が見られました。
アストロサイトは7日目までに結合した合流層を形成し、ミクログリアはプロセスが少なくなり、短くなりました。セルソーティングにより、単離された細胞培養の92〜93%の細胞生存率が確認されました。
