SARS-CoV-2 Pseudotype Virus Production and Serum Neutralization Assay

まず、6ウェルプレートに、1ミリリットルのヒト胚性腎臓293T細胞を播種します。2ミリリットルの完全DMEMを添加します。翌日、培地を抗生物質を含まない新鮮な培地と交換して、トランスフェクション用の細胞を調製します。

接着細胞をトランスフェクションするには、まず、プラスミドDNAを100マイクロリットルのOpti-MEMに添加してミックスAを調製します。次に、100マイクロリットルのOpti-MEMに17.5マイクロリットルのポリエチレンイミンを加えます。ミックスAとBの内容物を混合し、インキュベートします。

インキュベーション中は、3〜4分ごとにチューブを軽くはじいて、混合を促進します。HEK 293Tセルを含むプレートに混合物の全容量を加えます。16〜20時間のトランスフェクション後、培地を新しい完全DMEMと交換します。

プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%下でインキュベートし、偽型ウイルスを作製します。トランスフェクションの72時間後、上清をコレクションチューブに回収します。上清を1, 600Gで室温で7分間遠心分離する。

次に、上清を0.45マイクロメートルの酢酸セルロースフィルターでろ過します。50マイクロリットルの完全DMEMを96ウェルプレートのウェルに分配します。行 A は空のままにします。

次に、50マイクロリットルの溶液をA列からB列にピペットで移し、このプロセスを列Gまで繰り返して段階希釈します。培養感受性HEK 293T ACE2細胞を含むプレートから排出された培地を取り出し、4ミリリットルのDPBSで細胞を洗浄します。次に、DPBS生理食塩水中の1ミリリットルのトリプシンEDTAで細胞を剥離します。

次に、50マイクロリットルの感受性細胞懸濁液を、偽型ウイルスを含む各ウェルに加えます。プレートを摂氏37度、5%二酸化炭素で48時間インキュベートします。各ウェルに100マイクロリットルのルシフェラーゼ試薬を添加します。

インキュベーション後、各ウェルの内容物を黒色の96ウェルプレートに移します。次に、プレートリーダーでプレートを読み取ります。96ウェルプレートで、50マイクロリットルの新鮮な完全DMEMを列BからHの列1から10までに加えます.95マイクロリットルの新鮮な完全DMEMを列Aの対応するウェルに追加します.次に、50マイクロリットルの完全DMEMを列11のウェルに、100マイクロリットルのDMEMを列12に追加します。

5マイクロリットルの熱不活化血清サンプルを列Aにピペットで移動します.マルチチャンネルピペットで、最初の列のサンプルを混合し、50マイクロリットルの培地含有血清を列AからB列Hまで移します。プレートを摂氏37度、5%二酸化炭素で1時間インキュベートします。感受性HEK293T ACE2細胞の懸濁液を5ミリリットルで調製します。

50マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルに加え、インキュベートしてからルシフェラーゼアッセイを実施します。血清希釈率が低いと、細胞へのウイルスの侵入が減少しました。これは、中和の割合の増加によって確認されます。