まず、各ニードルに5マイクロリットルのAlexa Fluor標識GFPナノボディ溶液を充填します。スライドガラスの表面に 25 x 25 mm のカバーガラスを置きます。スライドに40マイクロリットルのハロカーボンオイルをピペットで移し、カバーガラスの周囲に沿って広げます。
注射顕微鏡の下で、針の先端を油に浸したカバーガラスの端に当てます。それに応じて、PicoPumpの噴射空気圧を調整します。空のスライドガラスを準備したショウジョウバエ胚スライドと交換します。
注射針の先端を胚の前後軸に垂直にセットします。XYステージマニピュレーターを使用して、先端が卵黄の中心に達するまで胚を針に誘導し、2〜3回ポンプで送液して卵黄に抗体を注入します。XYステージマニピュレーターを使用して、注射後に胚を針から遠ざけ、次の胚に移動します。
胚が所望の発育段階に達するまで摂氏25度でインキュベートします。インキュベーション後、明視野照明を備えた低倍率レンズで胚を識別し、高解像度の蛍光ライブイメージングのために40倍または63倍のレンズに切り替えます。注入後、ノッチ受容体のS/N比は、免疫蛍光法のシグナル品質に匹敵するほど大幅に改善されます。
さらに、抗体注入により、5分間のイメージングウィンドウにわたってシグナル強度の明らかな損失なしに、45秒間隔でのノッチ局在の時間的特性評価が可能になりました。胚性ホスホチロシンのライブイメージングにより、チロシンのリン酸化が三細胞接合部で高度に濃縮されることが示されました。さらに、ホスホチロシンシグナルの新たな第2の集団が頂端膜の中心の下に観察された。
デュアルカラーイメージングにより、このホスホチロシンシグナルの集団は内側ミオシン付近にあることが明らかになりました。さらに、ホスホチロシンの内側集団は、内側ミオシンに示されているように、同様の拍動性合体および散逸パターンを示しました。
