タンパク質分解ヒストンペプチドを分析するための LC-TIMS ToF MS/MS 分析法を開発するには、C-18 カラムを取り付けた HPLC と、独自のパッシブテクノロジーを備えた市販の TIMS ToF MS 装置を組み合わせます。次に、ナノエレクトロスプレーイオン化の動作条件を4、500ボルトのキャピラリー電圧、800ボルトのエンドプレートオフセット、3バールのネブライザー圧力、毎分10リットルの乾燥ガス、および200°Cのドライヒーターに設定します。MS 設定を 6 電子ボルトのコリジョンエネルギー、1200 VPP のコリジョン RF、75 マイクロ秒の転送時間、5 マイクロ秒のプレパルス保存に設定します。
注入量を 20 マイクロリットル(サンプルの 8 マイクログラムに相当)に調整し、流量を毎分 0.4 ミリリットルに設定します。指定したグラジエントタイムラインと 0.1%ギ酸の割合でアセトニド試験に入った後、両方のポップアップボックスで[OK]を選択してメソッドを保存します。水とアセトニトリル(いずれも 0.1% ギ酸を含む)を使用して 60 分間の非線形 LC グラジエントを実行します。
陽イオン化モードでのナノエレクトロスプレーイオン化により、HPLCからTIMS ToFへのサンプル溶出を検証します。MS-Digest ツールでペプチド配列と修飾部位を同定するには、Protein Prospector を使用してペプチドの理論リストを生成します。次に、消化条件、翻訳後修飾の種類、ペプチドサイズ範囲、質量検出範囲、および切断の欠落の潜在的な数を考慮して、理論的な消化を行います。
取得したデータを解析するには、各理論ペプチドについて、プラス 1 からプラス 4 までの複数のチャージ状態で質量を検索します。各質量電荷比を特定したら、ピークを選択し、ペプチド配列に基づくフラグメンテーションイオンの理論リストを使用して MSMS を確認します。翻訳後修飾を含む。
ペプチドのフラグメンテーションスペクトルにより、プロピオニル基やアセチル基など、さまざまな転写後修飾を持つ 3 つの異なるペプチド変異体が異なる位置にあることが明らかになりました。プロピオニル化ヒストン H3 標準試料は、非修飾バージョンよりも長いペプチドを示しました。HeLa S3細胞から抽出したヒストンは、同じアミノ酸位置で複数の翻訳後修飾パターンを示しました。
