まず、3.75ミリリットルの還元血清培地をAとラベル付けされたチューブにピペットで移し、105マイクロリットルのトランスフェクション試薬で培地を希釈します。チューブの内容物をボルテックスしてよく混ぜます。次に、3.75ミリリットルの還元血清培地をB.90マイクロリットルのエンハンサー試薬で発現プラスミドを希釈したチューブに入れます。
次に、チューブAの内容物をチューブBに加え、溶液をピペットでピペット化してよく混合してからインキュベーションします。準備したPhoenixエコプレートから10ミリリットルの細胞培養培地を慎重に取り出します。次に、トランスフェクションミックスの全容量をプレートに滴下します。
細胞をインキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。MTCMウイルス採取培地を摂氏37度のウォーターバスに入れて予熱します。次に、Phoenixエコプレートを傾けて、培地をピペットで取り出します。
次に、予め温めたウイルス採取培地30ミリリットルを、傾けたプレートにゆっくりとピペットで移します。細胞をインキュベーターに戻します。トランスフェクションの48時間後、ウイルス上清を回収します。
0.45マイクロメートルのPVDFフィルターでろ過します。滅菌シリンジの裏側で、分離したマウス脾臓を70〜100マイクロメートルのセルストレーナーで50ミリリットルの円錐形のチューブに押しつぶします。次に、5ミリリットルのT細胞分離バッファーでストレーナーを洗浄します。
細胞の最終容量を50ミリリットルにした後、血球計算盤で細胞を数えます。450 G、摂氏4度または室温で10分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。脾細胞を含む細胞ペレットを、推奨されるT細胞分離キットで再懸濁します。
次に、負の選択を使用してCD3陽性T細胞を単離します。磁気的に分離されたアイソレートを15ミリリットルのコニカルチューブに移します。セル数をもう一度確認します。
単離したT細胞を450G、摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、細胞ペレットをMTCM活性化培地に再懸濁します。次に、抗体でコーティングされた磁気ビーズとインターロイキン-2を細胞懸濁液に加え、T細胞を活性化します。
細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。0日目に、未処理の滅菌24ウェルプレートに0.5ミリリットルのヒトフィブロネクチン形質導入促進剤試薬をプレコートします。プレートは摂氏4度で一晩保管してください。
翌日、形質導入試薬をウェルから取り出します。等量の滅菌ろ過BSA添加PBSで室温で30分間ウェルをブロックします。インキュベーション後、BSA PBSを除去し、0.5〜1ミリリットルのPBSでウェルを洗浄します。
次に、1ミリリットルのきちんとしたレトロウイルスを各プレコートウェルに加えます。プレートを 2, 000 G で摂氏 32 度で 90 分間遠心分離します。次に、活性化されたT細胞を1ミリリットル、ウイルスを充填した各ウェルに加えます。
プレートを再び450 Gで32°Cで10分間遠心分離します。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。5日目に、細胞を再懸濁して、活性化されたT細胞を抗体でコーティングされたビーズから解離させます。
細胞懸濁液を磁石の上に30秒間置きます。次に、懸濁液をex vivo培養容器に移します。フローサイトメトリー解析の前に、容器を摂氏37度のインキュベーターに入れます。
T細胞単離キットの使用により、形質導入前のT細胞純度は98%未満でした。65〜75%の再現性のあるCAR発現率が達成されました。インターロイキン-7および15を用いたex vivo培養では、活性化後10日目までに単一の脾臓から15倍になりました。
インターロイキンによるT細胞の培養により、CD8陽性およびCD4陽性のT細胞頻度が同等になりました。10日間のex vivo培養後、幹細胞記憶集団が保存されることが観察されました。
