Hepatocellular Carcinoma Organoid Culture and Digestion to Study Liver Cancer Pathogenesis

オルガノイドプレーティングを行うには、まず遠心分離機から上清を取り出し、洗浄した肝細胞癌細胞を洗浄します。細胞をウェルあたり50マイクロリットルの基底膜抽出物(BME)に再懸濁し、プレーティングします。次に、高度なDMEM/F12でセルを一時停止します。

次に、均一な懸濁液が見られるまで、細胞凝集体を静かにピペットで固定します。懸濁液にBMEを添加し、BME濃度が30〜50%になるようにします次に、24ウェルプレートの中央に細胞クラスターを含む50マイクロリットルのBME液滴を播種します。液滴を摂氏37度で20分間固化させます。

500マイクロリットルの予熱した培地を各ウェルに加え、セルインキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。培地は2〜3日ごとにリフレッシュしてください。2週間後、分離培地をオルガノイド増殖培地と交換します。

7〜10日間の培養後、オルガノイドが適切な密度に達したら、必要に応じて培養を処理します。オルガノイドを継代するには、まずインキュベーターで超低接着表面の細胞培養プレートを予熱します。次に、冷凍BMEを使用直前まで摂氏4度で一晩解凍します。

オルガノイド回収溶液とトリプシン代替品を摂氏37度で30分間予熱します。調製段階に続いて、オルガノイド培養プレートから培地を取り出します。次に、オルガノイド懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。

次に、BMEの量に比例してオルガノイド採取溶液を追加します。懸濁液を混合するには、1000マイクロリットルのピペットガンを使用して、上下にこすり落とします。チューブを室温で30分間インキュベートした後、1ミリリットルのピペットを使用してBMEを慎重に吸引します。

BME が完全にディゾルブされていることを確認します。明確なオルガノイド細胞クラスターが見えるまで、10分ごとに抽出物をモニターします。その後、室温で400gで5分間遠心分離します。

上澄み液をできるだけ多く取り除きます。肝細胞がんオルガノイドの酵素消化を開始するには、培養オルガノイドペレットに予熱したトリプシン代替品を1〜5ミリリットル添加します。懸濁液を摂氏37度で2分間インキュベートします。

顕微鏡を使用して、オルガノイドが2〜10個の細胞の小さなクラスターに解離するかどうかを確認します。消化を止めるには、適切な量の冷たい基礎培地を追加します。次に、オルガノイドを400gで摂氏8度で5分間遠心分離します。

上澄み液をできるだけ慎重に取り除きます。必要な数のオルガノイドをプレーティング用の適切なマトリックスに再懸濁します。オルガノイド増殖の密度に応じて、オルガノイドを10日ごとに通過させます。

HCCオルガノイドスフェロイドは、培養後3日以内に観察されました。丸みを帯びたエッジと透過性サイトゾルを持つコンパクトなスフェロイドが、設立初日に見られました。オルガノイドは同様のサイズで、30〜50%BMEで培養した場合に最も大きな直径を示しました。

BMEは10%で最も断片化されており、その結果、オルガノイドが最も小さくなりました。BMEは100%で最も無傷でしたが、中間径のオルガノイドが得られました。増殖したHCCオルガノイドは、3世代後に各培養で500マイクロメートルを超えるサイズに達しました。

1000マイクロメートルを超える実質的にサイズのHCCオルガノイドが20日間の培養期間内に得られた。