まず、25マイクロリットルのハミルトンシリンジを使用して、麻酔をかけたラットの仔に15マイクロリットルのAddgeneを腹腔内に注射します。次に、麻酔をかけた生後6〜8週の子犬の毛とひげを剃ります。耳棒付きの脳定位固定装置フレームにラットを取り付けます。
そして、動物の体温を維持するために、下に温熱パッドを置きます。次に、出血を最小限に抑えるためにラットの頭に氷冷した生理食塩水に浸したガーゼの場所。サイズ15のメスで、頭蓋骨の上の皮膚と筋肉の正中線を切開します。
皮膚と筋肉を引き離して頭蓋骨を露出させます。1×4の丸いドリルビットで、頭蓋骨キャップに慎重に穴を開けて前脳を露出させます。次に、ロンゲールを使用して頭蓋骨を切り裂きます。
サイズ15のメスで、脳と嗅球を切開します。へらを使って、硬膜を頭蓋骨から慎重に外します。次に、切断された脳をそっと持ち上げて、三叉神経節と頭蓋底を表示します。
出血した出血を焼灼ペンで焼灼します。GCaMP6-Xを画像化するには、頭蓋腔を顕微鏡の対物レンズの下に置きます。次に、末端神経節に焦点を合わせます。
次に、顔の1平方センチメートルに機械的刺激を加えます。20倍の対物レンズを使用して、刺激に反応する三叉神経節のニューロンを可視化します。取得ソフトウェアで経時的に蛍光スタトを収集するには、取得メニューの下にあるストリーム取得ボタンを押します。
次に、フレーム数を 300 秒、取得時間を 90 秒に設定します。カメラのパラメータを設定して、フレームレートで画像を取得します。3分間にわたって安定したベースライン記録を取得します。
ウイルス力価が大きいほど、ラットの仔の神経感染が増加しました。軽い機械的刺激は、三叉神経節のV2領域のみを活性化した。安静時蛍光はほとんどのニューロンで比較的低く、自発的な増加はほとんどありませんでした。
自然刺激、特に中断刺激は、最も強力なニューロン応答を誘発しました。慢性狭窄損傷モデルにおけるブラシ刺激は、反対側と比較して、損傷者のピーク反応の大きさが2倍に増加しました。2つの刺激を直列に加えると、2回目の刺激に反応して有意な増幅が見られました。
