CDNA Library Preparation from the Drug Treated-Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Lysate for mRNA Sequencing

まず、遠心分離により処理したPBMCを回収し、細胞ライセートをPCRプレートに回収します。プレートを遠心分離して、底部にライセートを回収します。次に、サーモサイクラーを用いてmRNAの変性を行います。

次に、6マイクロリットルの逆転写酵素反応ミックスを各ウェルに添加して、合計容量12マイクロリットルにします。プレートを密封して、汚染を防ぎ、蒸発を防ぎます。プレートを短時間ボルテックスした後、遠心分離します。

プレートをサーモサイクラーにセットし、逆転写反応プログラムを開始します。逆転写後、PCRプレートを遠心分離し、15マイクロリットルの予備増幅ミックスを各ウェルに添加し、密封します。密封されたプレートをサーモサイクラーに置き、予備増幅反応を開始します。

cDNAをクリーンアップするには、各ウェルに磁気精製ビーズを添加し、室温で5分間インキュベートします。PCRプレートを磁気ラックに5分間、またはビーズが分離するまで置きます。その後、上澄みを慎重に取り除きます。

プレートを磁気ラックに保持しながら、100マイクロリットルの新しく調製した80%エタノールを静かに導入してビーズを洗浄します。30秒のインキュベーション後、ピペットを使用して上清を除去します。ビーズを磁気ラックで5分間、またはエタノールが完全に蒸発してビーズが光沢がなくなるまで風乾させます。

プレートを磁気ラックから取り外した後、ビーズを20マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。ビーズが分離されるまで、プレートを磁気ラックに再配置します。cDNAの品質管理およびタグメンテーション用に調製された新しいPCRプレートに溶出液を移します。

タグメンテーションの場合は、各反応のタグメンテーションミックスを3マイクロリットル新しいPCRプレートに加えます。すべての反応に1マイクロリットルのcDNAを加えます。タグメンテーション反応をすぐに開始します。

次に、各反応液に1マイクロリットルの中和タグメントバッファーを添加して反応を中和します。濃縮PCRでは、各反応液に9マイクロリットルの濃縮PCRミックスを添加して、総容量14マイクロリットルにします。濃縮PCRプログラムを開始します。