まず、6ウェル組織培養皿のウェルに滅菌カバーガラスを置き、カバーガラスを覆うように適切な量のポリ-L-リジンとラミネート溶液をウェルに注ぎます。次に、プレートをラップで密封して蒸発を抑え、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌朝、カバーガラスを滅菌PBSで3回洗います。
2ミリリットルの細胞懸濁液と増殖培地を、カバーガラスを含む各ウェルに10、000個の細胞をプレートに加えます。カバーガラスをPBSで洗浄した後、4%パラホルムアルデヒド溶液とPBSで18分間セルを固定します。カバーガラスをPBSで3回すすぎ、5分間待ってから免疫染色します。
免疫染色して洗浄したカバーガラスを、1〜5マイクログラムのヘキスト色素で10分間インキュベートします。次に、カバーガラスをPBSでさらに5分間洗浄します。PBSとグリセロールの混合物を等比でスライドにマウントし、蛍光顕微鏡で画像を撮影します。
細胞を非酵素的細胞解離溶液で30秒から1分間処理します。次に、非酵素的細胞解離試薬1ミリリットルごとに5ミリリットルのDMEMを添加します。血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
細胞を5Gで5分間遠心分離します。DMEM100マイクロリットルあたり6番目の細胞の1〜2倍の濃度で細胞を再懸濁します。動物を胃の上に置き、注射部位を70%エタノールで殺菌します。
6番目の細胞の1〜2倍10を右脇腹に皮下に注射します。マウスを寝具のないケージに単独で入れ、回復させます。低体温症を防ぐために、ケージの一部を加熱パッドの上に置きます。
初期継代のP0 GGFベータ3 MPNST細胞の低倍率および高倍率の画像が示されています。この細胞は腫瘍原性があり、軟寒天培地にコロニーを形成し、免疫不全マウスに移植片を形成することがわかった。
