形質転換 アグロバクテリウム・ツメファシエンスの スケールアップ培養と大型木本植物のアグロインフィルトレーション

まず、Agrobacterium tumefaciens細胞培養液を選択的抗生物質添加酵母マンニトール寒天培地にストリーク形質転換します。プレートを常設インキュベーターで摂氏28度で一晩インキュベートします。翌日、12.5ミリリットルの酵母マンニトールルリア-ベルタニブロスミックスの培養物からコロニーを接種し、28°Cのオービタルシェーカー上で250RPMで16時間インキュベートします。

112.5ミリリットルの酵母マンニトールブロスに12.5ミリリットルのアグロバクテリウム株LBA4404抗生物質を接種します。培養液を摂氏28度のオービタルシェーカーで250RPMで16時間インキュベートします。培養液で一晩培養液を光学濃度0.4に調整します。

次に、インキュベーション前に20マイクロモルのアセトシリンゴンを加えます。インキュベートした培養物が光学濃度1に達したら、遠心分離して細胞をペレット化します。ペレットを懸濁液に光学濃度0.6に再懸濁し、インキュベーション前に200マイクロモルのアセトシリンゴンを添加します。

農業浸透のために、葉のある枝を持つ木質カカオ植物を選びます。アグロバクテリウム懸濁液に250マイクロモルのジャスモン酸を加えます。次に、真空チャンバーとして真空計付きのデシケーターを設置し、内部の圧力を測定します。

植物の枝が通るようにジャンプリングを配置します。アグロバクテリウム培養液の入ったビーカーをデシケーター内に置き、デシケーターとその蓋の間に枝を置き、目的の葉をアグロバクテリウム培養液に浸します。次に、シリコーン印象材を使用して、ジャンプリング、植物枝、およびデシケーターの間の隙間を塞ぎます。

シリコーン材料が重合したら、隙間を残さずにデシケーターを閉じ、真空ポンプに接続します。マイナス0.07メガパスカルに達するまで真空ポンプを始動します。希望の圧力に達したら、圧力バルブを閉じ、ポンプをオフにして圧力を5分間維持します。

圧力バルブを徐々に着実に開いて、チャンバーの圧力を回復します。さらに2回浸潤を繰り返した後、細胞懸濁液から枝を取り除きます。浸潤した葉を蒸留水できれいにし、植物を摂氏25度で暗所に48時間置きます。

インキュベーション後、浸潤した組織を16時間の明色および8時間の暗色写真期間に曝露します。植物の浸透した葉は、特定の部分で暗く見え、アグロバクテリウムの浸透を示しています。レポーターシステムは、葉にベタレインを蓄積させ、肉眼で真っ赤な色素沈着として容易に観察することができます。

ベタレインの蓄積は、組織の生存率によって異なることが観察されました。.