まず、マルチチャンネルピペットを使用して、100マイクロリットルの10ミリモルシステインを滅菌フード内の96ウェルプレートのウェルにピペットで入れます。プレートをインキュベートした後、電極を傷つけないように、ウェルから溶液を慎重に吸引します。滅菌脱イオン水で井戸を2回すすぎます。
次に、調製したばかりのラットテールコラーゲン100マイクロリットルを各ウェルに1液ずつ加えます。薄光下でプレートを1時間十分にインキュベートした後、脱イオン水で2回洗浄します。次に、採取した脳内皮細胞を新鮮な滅菌トラフに移します。
マルチチャンネルピペットを使用して、100マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルに追加し、30秒で播種を完了し、1つのウェル培地を数学的モデリング目的のみに保持します。96ウェルプレートアダプターでは、両側の赤いクリップを外側に動かして、プレートを挿入できるようにします。正確には、プレートのAウェルをアダプターのAウェル領域に合わせ、プレートの上部に穏やかな圧力を加えて、プレートを所定の位置にしっかりと保持します。
次に、赤いクリップをロックして戻します。インキュベーターを閉じた後、セットアップを押して装置を起動すると、正しく検出されたすべてのウェルがプレートマップ上に緑色で示されます。チェックボタンを押して、絶対インピーダンスの読み出しを認証します。
次に、プレートマップの下にあるドロップダウンメニューを使用して、実験に使用するプレートのタイプを選択します。マルチ周波数を選択して、さまざまな交流周波数でのインピーダンスを測定します。最後に、開始ボタンをクリックして実験を開始します。
オームの増加によって示される高抵抗の単層が形成されるまで、細胞を増殖させます。治療液を調製する前に、細胞増殖が停滞に達していることを確認してください。処理溶液を調製するには、ラベル付きの1.1ミリリットルポリプロピレンクラスターチューブをストリップチューブプレートに入れます。
50マイクロリットルの治療用サイトカインまたは細胞を3つ、あらかじめ用意されたプレートマップに従ってチューブに加えます。それから暖かさのためにそれらをインキュベーターに入れます。EIS ソフトウェア上。
一時停止をクリックすると、進行中のテストが一時的に停止します。プロンプトが表示されたら、インキュベーターを開き、プレートをしっかりと保持しながら両方の赤いクリップを慎重に解放します。実験を一時停止した状態で、プレートを滅菌フードに移します。
次に、インキュベーターから処理ストリッピングチューブを取り外します。マルチチャンネルピペット付き。剥がした治療チューブの内容物を慎重に再懸濁します。
次に、剥がしたチューブから100マイクロリットルの処理をピペットで取り出し、96ウェルプレート上の適切なウェルに移し、セルフリーウェルに完全な培地のみを追加します。プレートを過度に冷却すると、内皮細胞単分子膜の抵抗に影響を与える可能性があるため、5分以内にピペッティングを完了するようにしてください。処理されたプレートを機械に再度取り付けてから、電極のウェルインピーダンスを評価します。
正しいマルチ周波数集録設定とプレートカタログが選択されていることを確認します。次に、再開を押して実験を続行します。実験が目的のエンドポイントまで進行したら、[完了]を押して、記録されたファイルを自動的に保存します。
ファイルに移動し、[データのエクスポート]をクリックして、データをXLSまたはCSVファイルとしてエクスポートし、さらに分析します。抵抗性の増加は30時間にわたって観察され、内皮細胞の成長段階を示しています。成長期には、細胞は48時間までに異なるレベルでプラトー化され、測定の標準化により、耐性変化のより信頼性の高い解釈が可能になりました。
治療前の脳内皮細胞の細胞数が正しくないと、成長期が変動し、徐々に低下して安定した耐性のプラトーになりました。細胞播種密度とローディング量を最適化することで、最適な増殖期が得られました。サイトカインはバリアに一過性の影響を与えるようでした。
メラノーマ細胞の追加により、バリア抵抗性が劇的に減少しました。傍細胞バリアと基底外側成分は、サイトカインの添加により変動し、メラノーマ細胞の添加は、基底外側成分と比較して傍細胞バリアのより大きな減少をもたらしました。
