まず、採取したヒト精液サンプルを液化し、パスツールピペットを使用して完全に均質化します。次に、精液サンプル100マイクロリットルを遠心分離チューブに移します。このチューブに、900マイクロリットルの染色液を加えます。
ピペッティングで混合を繰り返し、反応物を完全に均質化します。チューブを2次元シェーカーの上に置き、室温で200RPMで30分間連続的に撹拌します。染色反応を待つ間に、CASAシステムを用いた精子濃度の分析を進めます。
システムの電源を入れた後、SCAscopeアイコンをダブルクリックしてアプリケーションソフトウェアを開きます。次に、精液サンプルをピペッティングで完全に混合し、最大10マイクロリットルのサンプルをSCA計数チャンバーに移します。精液サンプルの漂流が止まるまで60秒間待ちます。
次に、SCA計数チャンバーをCASAシステムのサンプルホルダーに置きます。アプリケーションソフトウェアで、ダイアログボックスに患者の情報を入力します。開始ボタンをクリックして、精液中の精子の濃度を記録します。
その後、30分間の染色反応が完了したら、シェーカーを停止します。分析の前に、遠心分離管の内容物をピペッティングで混合します。最大10マイクロリットルの反応物を精子計数チャンバーに移し、専用のガラスカバースリップで覆います。
精子計数室を顕微鏡ステージに置き、光学顕微鏡の電源を入れます。次に、反応物サンプルのドリフトが止まるまで60秒間待ちます。10倍対物レンズの下で、コースと微調整ノブを調整して視野を選択します。
次に、40倍の対物レンズに切り替えて、精子とペルオキシダーゼ陽性の白血球を観察します。電子カウンターシステムを使用して、少なくとも200個の精子と茶色のペルオキシダーゼ陽性白血球の数をカウントします。この技術を用いて、ペルオキシダーゼ陽性白血球を精液サンプル中で染色した。
ペルオキシダーゼ陽性の白血球は、染色されていない通常の丸い細胞とは対照的な茶色の色合いを示しました。
