心血管研究のためのマウス大動脈および腸間膜動脈から単離された血管壁常在型CD34⁺ 幹細胞の磁気分離

まず、大動脈の外層と麻酔マウスから単離された腸間膜動脈の最初の枝を分離して培養します。細胞が80%コンフルエントになったら、解離した細胞懸濁液を室温で300Gで5分間遠心分離し、上清を完全に廃棄し、細胞ペレットを総細胞数1,000万個あたり98マイクロリットルのソーティングバッファーに再懸濁します。CD34抗体を添加した後、細胞を暗所で4°Cで30分間インキュベートします。

細胞を洗浄するには、細胞に2ミリリットルのソーティングバッファーを加え、300Gで10分間遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞を80マイクロリットルのソーティングバッファーに再懸濁します。次に、20マイクロリットルの抗FITCマイクロビーズを細胞懸濁液に加えます。

前述したように細胞を洗浄し遠心分離した後、細胞を1ミリリットルのソーティングバッファーに再懸濁します。次に、セパレーターの磁場内に磁気分離カラムを配置し、カラムの下に収集チューブを配置します。500マイクロリットルのバッファーですすいだ後、細胞懸濁液をカラムにロードし、標識されていない細胞を含む流れをコレクションチューブに集めます。

カラムをセパレーターから取り外し、新しい15ミリリットルの遠心分離チューブに置きます。500マイクロリットルのソーティングバッファーをカラムに導入し、プランジャーをカラムに押し込んで、磁気的に標識されたセルを洗い流します。