ヒト人工多能性幹細胞の肝臓分化を開始してから27日後、ウェルあたり2ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。所定の成分を使用して、ADSバッファーに酵素溶液を調製します。6ウェルプレートのウェルあたり1ミリリットルの溶液を加えます。
プレートを摂氏37度にした回転式シェーカーに約2時間置き、プレートから細胞を剥離します。顕微鏡で細胞の剥離を確認した後、細胞懸濁液をピペットで動かして単一細胞に分散させ、肝細胞成熟培地を入れた50ミリリットルのチューブに回収します。細胞懸濁液を200Gで18°Cで5分間遠心分離します。
そして、吸引器を使用して、上清を取り除きます。細胞のミトコンドリアを染色するために、100ナノモルTMRMを含む5ミリリットルの肝細胞成熟培地にペレットを再懸濁します。細胞を光から保護しながら、摂氏37度で30分間インキュベートします。
再度、細胞懸濁液を遠心分離し、2%FBSを含む1〜5ミリリットルの冷たいADS緩衝液にペレットを再懸濁します。細胞計数後、500,000個の細胞を1.5ミリリットルのチューブに分注し、一次抗体コントロールなしとして標識します。残りの細胞懸濁液を200Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を除去します。
100万細胞あたり100マイクロリットルの希釈一次抗体を添加します。細胞懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移し、氷上で50分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞懸濁液を遠心分離し、2%FBSを含む冷ADSバッファーで細胞を2回洗浄します。
次に、100万細胞あたり100マイクロリットルの希釈二次抗体を一次抗体、染色細胞または未染色細胞に添加し、氷上で30分間インキュベートします。再度、細胞懸濁液を遠心分離し、2%FBSを含む冷ADSバッファーで細胞を2回洗浄します。ADSバッファーに細胞を再懸濁した後、スナップキャップセルストレーナで細胞をろ過し、チューブを氷上に置きます。
