凍結乾燥したMOG 35 55ペプチドを水に再懸濁することから始めます。実験前に、ペプチドストックをコーティングバッファーで10マイクログラム/ミリリットルに希釈します。次に、最終溶液の100マイクロリットルを96ウェルプレートのウェルにピペットで移します。
コーティングバッファーに溶解した100マイクロリットルのBSAで同数のウェルを同時にコーティングします。プレートを粘着フィルムで密封して蒸発を防ぎ、プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、0.5%トゥイーン20を添加した200マイクロリットルのPBSでプレートを3回洗浄します。
続いて、PBS中の3%BSAからなるブロッキング溶液のウェルあたり100マイクロリットルを加えます。密封されたプレートをハイブリダイゼーションオーブンで摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、PBSTのウェルあたり200マイクロリットルでプレートを3回洗浄します。
EAE免疫マウスの血液から得られた各血清サンプルをブロッキング溶液で希釈し、MOG 35、55およびBSAコーティングウェルの両方にウェルあたり100マイクロリットルを加えます。同量のブロッキング溶液を指定のブランクウェルに添加します。密封されたプレートを室温で2時間、絶えず振とうしながらインキュベートします。
インキュベーション後、インキュベーターからプレートを取り出し、PBSTのウェルあたり200マイクロリットルでプレートを3回すすいでください。HRP標識二次抗体をPBST中の0.2%BSAからなる溶液で希釈し、各ウェルに100マイクロリットルを加えます。密封したプレートを室温で1時間インキュベートし、一定の振とうを維持します。
PBSTのウェルあたり200マイクロリットルでプレートを3回洗浄します。各ウェルに3、3プライム、5、5プライムテトラメチルベンジジン基質の100マイクロリットルを追加します。暗闇の中で1〜5分間インキュベートし、青色の発育を監視します。
各ウェルに100マイクロリットルの停止溶液を加えます。次に、波長450ナノメートルに設定されたプレートリーダーを使用して、各ウェルの光学密度を測定します。EAEサンプルの光学密度値は、対照サンプルよりも有意に高く、MOGペプチドに対する強力な免疫グロブリンG応答を示しました。
