まず、生細胞解析システムソフトウェアを起動します。画面の左上隅にあるプラス記号を押して、容器の追加を開始します。[スケジュールに従ってスキャン] を選択し、[新規] を選択してスキャン プログラムを実行します。
[標準] を選択します。次に、セルごとのオプションとしてスキャン設定を「なし」に、画像チャンネルを「位相」、「緑」、「赤」に設定し、それぞれの取得時間を設定します。目標を 20x に設定します。
リストからプレートを選択し、イメージングシステムのトレイにプレートを置く容器の位置を選択します。サンプルを含むウェルを選択し、ウェルごとにキャプチャする画像の数を決定します。この情報により、プレートの推定スキャン時間が自動的に生成されます。
Create Plate Mapをクリックし、細胞タイプや化合物などの各ウェルの情報を入力します。次に、スタディに名前を付けます。次の画面で、解析タイプとして[基本アナライザ]を選択し、以前に使用した解析定義を表示するドロップダウンリストから[解析定義]を選択します。
緑と赤の両方のスペクトルアンミキシングは 0.0 のままにします。スキャンを 15 分から 20 分ごとに 8 時間実行するようにスケジュールします。画面上部の白と灰色のバーをドラッグして、スキャンの開始時刻を設定します。
次の画面でスキャン設定を確認し、[スケジュールに追加]を押してスキャンを開始します。スキャン後、[表示]タブで、分析用の容器を開きます。画面の左側にある[分析の起動]を押し、[新しい分析定義の作成]を選択します。
「基本アナライザー」を選択し、「位相」、「緑」、「赤」、および「オーバーラップ」の画像チャンネルを使用します。トレーニング用の代表的なサンプル画像を 6 つから 8 つ選択します。解析定義を構成するには、好中球細胞外トラップ(NET)を形成する好中球に緑のオブジェクトを、すべての好中球の核に赤色のオブジェクトを設定します。
「現在のプレビュー」または「すべてプレビュー」を押し、各パラメータを調整して結果を最適化します。分析するスキャン時間とウェルを選択します。次に、分析定義のラベルを指定します。
概要を確認し、分析を開始します。解析後、解析定義の名前をダブルクリックして、解析スタディを開きます。画面の左側にある[レイヤー]を開き、各セルが正しくマークされているかどうかを確認します。
画面の左側にある「グラフメトリック」をクリックし、「緑色のカウント」で「画像ごとのカウント」を選択します。エクスポートするタイムポイントと井戸を選択します。グループ化を選択するには、プレートマップの複製を選択して、スキャン中にすべてのウェルが正しく指定されていることを確認し、データのエクスポートをクリックします。
同様に、赤のカウントとオーバーラップのカウントのデータをエクスポートします。与えられた式を使用して、各条件と時点のセルを形成するNETの割合を計算します。NET形成の経時変化は、各時点でのNET形成好中球の割合をプロットすることによって可視化されます。
AKT阻害剤を添加すると、PMAまたはカルシウムイオノフォアで刺激された好中球のNET形成がブロックされました。NET形成を標的とする潜在的な分子の実証は、この方法論を用いてハイスループット方式で試験することができます。
