まず、蛍光色素標識EV-microRNAおよび細胞-microRNAをトランスフェクションしたCalu6細胞を採取します。丸底ポリスチレン製FACSチューブに付属の35マイクロメートルのストレーナキャップで細胞懸濁液をろ過します。次に、フローサイトメトリー装置をセットアップし、フローサイトメーターのスイッチを入れ、使用前に30分間ウォームアップします。
流体システムをシース液でプライミングします。その後、レーザーアライメントを確認して調整します。品質管理のために、超高純度ろ過水をフローサイトメーターにロードし、適切な流速で分析することで、適切な取得時間を確保します。
次に、FSC 5, 000 の Calu6 細胞からのシグナルを捕捉するための閾値を設定します。蛍光色素間のスペクトルオーバーラップを考慮するには、トランスフェクションされていない細胞と、1つの蛍光色素のみでトランスフェクションした細胞を用いて、コンペンセーションコントロールを調製します。FSC、SSC、FITC、およびPEチャンネルをそれぞれ258、192、269、および423の電圧単位に設定して、トランスフェクションした細胞で発現解析を実行します。
次に、ネガティブコントロールサンプルをフローサイトメーターに導入します。カスタムワークシートでFSC強度とSSC強度を定義した後、細胞シグナルをキャプチャします。プロットのX軸にFSCを、Y軸にSSCを選択します。
対象の母集団の周囲にポリゴンを描画して、軸上にゲートを作成します。ゲーテッド母集団を使用して新しいプロットを作成するには、X軸を蛍光シグナル1に設定します。細胞-マイクロRNA検出用、およびEV-microRNA検出用Y軸から蛍光シグナル2用。
蛍光タグ付けされた各マイクロRNAを独立してトランスフェクションした細胞を用いて、個々の蛍光色素の代償パラメーターを確立します。cell-microRNAおよびEV-microRNAをトランスフェクションした細胞のフローサイトメトリー解析により、EV-microRNAに対応する蛍光シグナルが連続的に減少することが明らかになりました。対照的に、細胞マイクロRNAに対応するシグナルは細胞内に保持されており、蛍光色素が細胞によるマイクロRNAの保持に影響を与えないことを示しています。
