まず、Calu6細胞から単離したEVを、蛍光色素標識EV-micro RNAおよび細胞-micro RNAでトランスフェクションします。EVを適切な量の限外ろ過PBSで希釈し、フローサイトメトリー分析用の細胞外小胞懸濁液を調製します。ナノフローサイトメーターを使用して、ナノサイズの粒子を分析します。
ソフトウェアを起動し、推奨される校正手順に従って機器を設定します。高性能ナノビーズを使用して、性能試験を実施します。装置の性能は、ナノビーズが標準サイズ範囲内で検出された場合に最適と見なされます。
EV粒子検出に適した流量を決定します。次に、超純度ろ過水を使用して品質管理チェックを行い、機器の流路系を検証し、検出器とレーザーの性能を評価します。パラメーターを設定して、メーカーのプロトコルに従って、ビーズミックス中のさまざまな集団の感度と分離能を評価します。
次に、適切なゲーティングを適用して、ビーズ集団と装置のノイズを区別します。次に、サンプルを徹底的にボルテックスして、EVが均一に分布するようにしてから、分析のためにロードします。フローサイトメトリーデータ解析ソフトウェアを起動し、限外ろ過PBSを導入します。
限外ろ過されたPBSを使用して、EV粒子のゲーティングを設定し、キャリブレーションに基づいてゲートが粒子の適切なサイズに対応するようにします。同調された互換性のあるチューブに移され、ボルテックスされたEVを取り、そのチューブを機器にロードします。X 軸に FSC、Y 軸に SSC をプロットしながら EV 信号をキャプチャします。
x 軸の細胞マイクロ RNA 検出には蛍光シグナル 1 を選択し、y 軸の EV マイクロ RNA 検出には蛍光シグナル 2 を選択します。単一のマイクロRNAをトランスフェクションした細胞から単離したEVサンプルを使用します。蛍光色素の補正パラメータを確立しました。
フローサイトメトリーにより、EVにおけるmiR-451a、Alexa fluor-488の時間依存的な蓄積が明らかになり、効率的なパッケージングとリリースがサポートされています。対照的に、細胞miR-67の蛍光はEVでは観察されませんでした。
