がん診断のためのナノセンサー特性評価とCRISPR-Cas媒介尿バイオマーカー検査

まず、2ミリグラムの多価PEGをマレイミド反応性基で溶解し、1ミリリットルの100ミリモルリン酸緩衝液を溶解します。0.2マイクロメートルのフィルターで溶液をろ過します。システイン末端DNAペプチドコンジュゲートを溶液に加えます。

サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、非標識物質を除去します。PBS でサンプルを実行します。の吸光度を監視して、DNAとペプチドを検出します。

サンプルを遠心フィルターチューブに入れ、合成したナノセンサーをメーカーの推奨速度に従って遠心分離して濃縮します。96ウェルプレートをカスタムハウジングチャンバーのベースとして使用します。ベースライン測定のために尿を採取するには、まずマウスをハウジングチャンバーに入れます。

拘束されたマウスの膀胱に穏やかな圧力をかけて、残っている尿をプレートに排出します。採取した尿を1.5ミリリットルのチューブにピペットで移します。滅菌PBSで200マイクロリットルのナノセンサー注入溶液を調製します。

各マウスに200マイクロリットルの溶液を静脈内注射します。1時間の注射後、対照マウスと実験マウスから尿サンプルを採取します。DNAバーコードの蛍光ベースのCRISPR検出には、尿サンプルを室温で800 Gで5分間遠心分離します。

次に、CRISPR試薬を混合し、Cas12a酵素を添加してから、反応混合物を静かに上下にピペッティングします。反応混合物を摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、FRETベースのレポーターDNA混合物を使用してレポーター反応を実行します。

混合物を384ウェルプレートに加え、直ちに摂氏37度で2分ごとに蛍光を3時間測定し、切断速度をモニターします。紙ベースのCRISPR検出を行うには、FAM-ビオチン標識DNAレポーターを使用して、CRISPR反応のインキュベーション後に代替レポーター反応を実行します。試薬を96ウェルプレートに合わせた後、アルミホイルで覆い、プレートを摂氏37度のインキュベーターに30分間入れます。

次に、80マイクロリットルのPBSを96ウェルプレートの新しいウェルに加えます。このウェルに20マイクロリットルのレポーター反応混合物をピペットで移します。ラテラルフローペーパーストリップを各ウェルに置き、液体がストリップの上部に到達するまで待ちます。

化学修飾された一本鎖DNAは、非修飾の二本鎖DNAおよび一本鎖DNAと比較してCas12aの活性化を示しました。未処理の尿中の修飾されたDNA分子は、ラテラルフロー紙ストリップに比色表示を示しました。先行するサンプルバンドは、尿中DNAによって引き起こされるレポーター切断を介して検出可能なFAMの放出を示しました。