まず、PDMSマイクロウェルモールド、付着防止リンス液、および必要なラボウェアを組織培養フードに入れます。PDMSマイクロウェル金型を洗浄するには、1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、各ウェルに300マイクロリットルの付着防止洗浄液を追加します。次に、プレート1, 620 Gを3分間遠心分離します。
真空ポンプとパスツールピペットを使用して溶液を吸引します。次に、500マイクロリットルの細胞懸濁液を所望の濃度でマイクロウェルに入れ、プレートを1, 620Gで3分間遠心分離します。プレートを加湿したインキュベーターに入れて、スフェロイドを形成します。
スフェロイドを収穫するには、1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、各ウェルに500マイクロリットルの完全な培地をしっかりと加えます。添加した培地を各象限で3〜4回上下にピペットで移し、胞子体を取り除きます。次に、ピペットを使用して、スフェロイドを含む培地を微量遠心チューブに静かに吸引します。
50マイクロリットルのステロイド懸濁液を微量遠心チューブに移します。次に、4アームPEGアクリレートとPEGジチオールを順次添加します。得られた溶液をピペッティングで約10回上下させて混合します。
100マイクロリットルの10質量%重量のPEGヒドロゲル前駆体溶液を得るには、1ミリメートルのシリコンスペーサーで分離した2つのパラフィルムで裏打ちされたスライドガラスの間に20マイクロリットルのゲル前駆体溶液をピペットで移し、ゲル化を可能にするためにスライドをゲル前駆体溶液とインキュベートします。ハイドロゲルのゲル化が完了したら、スパチュラを使用して、分離したスライドガラスからゲルをそっと剥がします。ウェルごとに 1 つのゲルを 24 ウェルプレートに入れ、スフェロイドを含む表面が上を向くようにします。
各ウェルに500マイクロリットルの完全培地を加えて、ヒドロゲルを完全に沈めます。マルチウェルプレートを加湿したインキュベーターに入れ、細胞を培養します。マイクロウェルモールドを用いた記載技術により、球形および厳密に制御された多分散性を有するスフェロイドの形成が得られた。
マイクロウェルあたり3, 300個の細胞を有するスフェロイドの場合、平均スフェロイドサイズは約250ミクロンであり、真円度は0.8より大きく、値1を完全な球と見なした。スフェロイドの直径は、マイクロウェルのサイズとマイクロウェルあたりの細胞数に依存していました。
