まず、ハイドロゲルでカプセル化した細胞を24ウェルプレートで培養するウェルから培地を吸引します。500マイクロリットルのPBSをヒドロゲルを含む各ウェルに直接ピペッティングしてハイドロゲルをすすぎ、PBSを静かに吸引します。1, 000 マイクロリットルのピペットを使用して、ウェルあたり 500 マイクロリットルの固定液を添加し、スフェロイドを 24 ウェルプレートに固定します。
固定液を室温で30分間ゲルに浸してから、固定液をピペッティングして指定の廃液容器に廃棄します。次に、前述のように、ハイドロゲルをPBSで3回すすぎます。すぐに使用しない場合は、ハイドロゲルをウェルあたり500マイクロリットルのPBSに入れ、摂氏4度で最大1週間保管してください。
ハイドロゲルでカプセル化した細胞で染色するには、まず、ネスチンおよびSOX2用の適切に希釈した一次抗体を調製します。ウェルからPBSを吸引した後、希釈した抗体を50マイクロリットル各ウェルに加えます。細胞を抗体と24時間インキュベートして、完全に染色します。
次に、1, 000マイクロリットルのピペットを使用して、染色液を除去し、廃棄物を適切に廃棄します。ハイドロゲルを3回すすぎた後、イメージングまたはイメージングの前に、摂氏4度のPBSで最大2週間保存するか、すぐにイメージングします。染色されたスフェロイドを透明化してイメージングの透明性を向上させるには、まず各ウェルからPBSを吸引します。
次に、スフェロイドをウェルあたり500マイクロリットルの20%40%および80%ホルムアミドでそれぞれ90分間順次処理します。最後に、イメージング前にハイドロゲルを100%ホルムアミド中で24時間インキュベートします。スフェロイドは、さまざまなzスタック深度でイメージングされ、zスタック内の各位置での細胞生存率の評価が可能になりました。
回転楕円体スタックを利用した最大投影法は、各位置内の光強度の最高点を表し、1 つの画像に単純化されました。染色したスフェロイドの代表的な画像から、自己複製転写因子であるSOX2が核内でDAPIと共局在していることが明らかになりました。それどころか、幹細胞マーカーネスチンは細胞全体に存在していました。
ゲルを含まない自由浮遊スフェロイドとカプセル化されたスフェロイドの間に違いはありませんでしたが、これはおそらく使用したPEGゲルの不活性によるものと考えられます。透明な回転楕円体と透明でない回転楕円体の約90ミクロンの光学切片の代表的な画像から、透明化を行うと、透明化されていない回転楕円体と比較して、回転楕円体コアを約30ミクロン深く画像化できることが明らかになりました。
