まず、選択した酵母形質転換体を3ミリリットルのSD URA培地で摂氏30度で飽和に達するまで増殖させます。培養液の光学濃度を600ナノメートルで測定します。室温で 14 、 000 G で一晩培養した 2 ミリリットルを遠心分離します。
上清をピペットで取り出します。ペレットを1ミリリットルのMES緩衝液に再懸濁します。混合物を室温で14, 000 Gで遠心分離する。
次に、上澄み液を取り除きます。細胞をMES緩衝液で再度洗浄した後、細胞を2ミリリットルのMES緩衝液に再懸濁します。次に、全容量を試薬リザーバーに注ぎます。
次に、マイクロプレートリーダーをセットアップします。プロトコルの管理アイコンに移動し、測定タイプを蛍光強度に、読み取りモードをスペクトルスキャンに設定します。マイクロプレート名をGREINER 96 F BOTTOMに入力し、底面光学系をセットします。
光学系設定にアクセスするには、スキャンオーバーエミッションの設定を選択します。励起波長を433ナノメートルに調整し、励起帯域幅を10ナノメートルにします。発光波長範囲を460ナノメートルから550ナノメートルに設定し、発光帯域幅を10ナノメートル、ステップ幅を1ナノメートルに設定します。
設定時間を0.1秒に設定します。次に、96ウェルの透明な底の黒板のウェルにさまざまな濃度の塩化ナトリウム溶液を調製します。150マイクロリットルのMES緩衝液を列Aの最初の3つのウェルにロードし、次に、対応するオスモライト溶液150マイクロリットルを左から右に順にピペットで移します。
12チャンネルマイクロピペットを使用して、洗浄した酵母懸濁液を複数回ピペットで操作します。次に、50マイクロリットルの細胞懸濁液を各ウェルに移します。各ウェルの内容物を複数回ピペットで移動し、均一に混合します。
蛍光強度発光スペクトルを直ちに測定します。画面に表示されている蛍光発光スペクトルを観察します。IDRコンストラクトは、mCerulean3とシトリン発光スペクトルの組み合わせを示しました。
AtLEA45では、高浸透圧ストレスによりアクセプターの蛍光強度が増加し、ドナーの蛍光強度が低下しました。これはアルブミンコンストラクトでは観察されませんでした。.
