1 まず、生細胞2 HaloTag タンパク質凝縮物の 1 分子イメージングを行います。3 ImageJ を使用して、生のイメージングデータファイル 5 の各チャネル 4 を独立した TIFF ファイルに変換します。6 必要に応じて、プリトラッキング コームを実行します。
テキスト7を入力し、プロンプト8に従って、フレームを最新のフレームに置き換えます。9 SlimFastでムービーファイルの単一分子をロードするには、10 loadをクリックし、続いて画像スタックをクリックします。11 ローカライゼーション12と取得のパラメータをそれぞれのオプションシートで設定します。
13 すべての分子の局在化を視覚化します。14 そして、lock all を使用して、15 は、各フレーム内のすべての分子の局在化 16 を含むファイルを生成する。17次に、粒子データ18のロードに移動し、SlimFastを選択して、ローカリゼーションおよび取得設定を含むファイル19をロードする。
20 オプションとシートトラッキングを使用して、21 軌道生成のパラメータを調整します。22 gen trajをクリックして、すべての分子の軌跡を含むファイル23を生成する。24 シート追跡ファイルをeval SPT 25にロードし、パラメータ26を設定して、2.5秒未満の軌跡をフィルタリングします。
27 エクスポートデータを使用して、フィルタリングされたすべての軌跡を含むファイル28を生成します。29 ImageJマクロ、nucleus、30、およびクラスタマスクバージョン2の実行。テキスト、31は、JFX549チャネルで取得されたムービー32のすべてのフレームを閾値し、凝縮物の位置を強調表示する時間展開バイナリマスク34が装着されたタイムラプスムービー33を生成する。
35 ASCIIスロートラッキングCSSの変換を使用 3.M、36は軌道37を再フォーマットし、分類バージョン4を実行します。分子が凝縮物中で過ごす寿命39に基づいてそれらを分類するM38。
40次に、プロットレジデンスヒストCSSを使用します。M、41は、目的とする凝縮物44タンパク質およびH2B軌道から、特異的に結合した分子43の観測された解離速度42および光退色速度を抽出する。45 最後に、目的のタンパク質、47がその凝縮物に特異的に結合したタンパク質の補正平均滞留時間46を計算する。
TAF15 IDR-Halo-FTH1の2色1分子動画49のフレームは、PA-JF646チャネルとJFX549チャネルの両方の原子核からの信号50を示している。51 組み立てと選別を行ったところ、PA-JF646の軌道53に明確な区別が観察され、凝縮物に結合した分子が検出されました。54 光退色補正後55の算出平均滞留時間55は、Halo-TAF15よりもTAF15-Halo-FTH1の方が長かった。
