抗原コーティングを開始するには、オボアルブミンをコーティングバッファーで1ミリリットルあたり5マイクログラムに希釈します。96ウェルのELISAプレートに、ウェルあたり100マイクロリットルのオボアルブミン溶液を摂氏4度で一晩コーティングします。翌日、PBSTで井戸を5回洗います。
250マイクロリットルの1%BSA PBSTで摂氏37度で2時間井戸をブロックします。1000倍の血清希釈液を調製するには、まず0.5%BSA PBSTを使用して20マイクロリットルの血清を1ミリリットルに希釈します。次に、25マイクロリットルの血清アリコートを取り除き、0.5%BSA PBSTを使用して500マイクロリットルに希釈します。.
1000 Xに希釈した200マイクロリットルの血清をコーティングされたプレートの最初の列に加えます。次に、100マイクロリットルの0.5%BSA PBSTを、最初の列の井戸を除くすべての井戸に追加します。1列目から2列目に100マイクロリットルを移し、10回混ぜます。
IgG検出用にさまざまな濃度の血清を作成するには、最後の列から100マイクロリットルの液体を廃棄します。次に、マウスの膣洗浄液、気管支肺胞洗浄液、鼻洗浄液を0.5%BSA PBSTで希釈し、小腸洗浄液を20%ウシ胎児血清PBSTで希釈します。プレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。
PBSTで井戸を5回洗います。100マイクロリットルのHRP標識ヤギ抗マウス抗体を適切なウェルに添加し、摂氏37度で40分間インキュベートします。PBSTでウェルを5回洗浄した後、100マイクロリットルのTMB ELISA基質を加え、光保護エリアで5分間インキュベートします。
100マイクロリットルの450ナノメートル停止溶液を加えて反応を終了します。マイクロプレートリーダーで450ナノメートルの吸光度を測定します。抗体価を計算し、陽性反応値を対照マウス群の血清値の2.1倍と定義します。
ナノエマルジョンアジュバントワクチンは、血清中のオボアルブミン特異的IgG、IgG1、およびIgG2a抗体価を有意に増加させた。膣洗浄液および小腸洗浄液中の特異的IgAのレベルは、オボアルブミンをカチオン性ナノエマルジョンカプセル化レチノイン酸でアジュバントすると有意に上昇した。
