まず、マウスから分離された大腿骨、脛骨、骨盤、上腕骨を取ります。メスを使って長骨の成長板を切り裂き、骨端を取り除きます。M199培地と2%FBSを氷の上に置いた10センチの皿に入れます。
次に、28ゲージの針とM199培地と2%FBSを充填した10ミリリットルの注射器を使用して、骨髄を氷上の15ミリリットルのチューブに洗い流します。洗い流した骨を骨端のある皿に入れます。骨髄が落ち着くまで、15ミリリットルのチューブを氷の上で直立させます。
次に、M199培地と2%FBSを取り出します15ミリリットルのチューブに4ミリリットルのB&M解離カクテルを追加し、摂氏37度の水浴でインキュベートします。インキュベーション後、上清を回収し、70μmのセルストレーナーでろ過して冷たい50ミリリットルのチューブに入れます。残りの骨髄ペレットに2ミリリットルの新鮮なB&M解離カクテルを加え、水浴に戻します。
1ミリリットルのピペットを使用して、残っている骨髄片を精力的にピペットで動かします。前回と同じチューブにすべての細胞懸濁液を回収します。20ミリリットルのM199培地を0.5%BSA含有、および2ミリモルEDTAを細胞懸濁液に加えます。
その後、細胞を500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。ペレットを500マイクロリットルのPBSに再懸濁し、0.5%BSA抗体とビオチン抗体を添加します。オービタルシェーカーで、暗所の室温で10分間インキュベートします。
次に、磁気ビーズをしっかりと渦巻きます。25マイクロリットルのビーズをチューブに加え、オービタルシェーカーで再度インキュベートします。チューブを対応する磁石に2〜3分間置き、上清を新しいチューブに集めます。
50ミリリットルのチューブの平らなキャップエンドを使用して、10センチの皿で骨を小さく砕きます。上清を70マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、骨片を分離します。セルストレーナーの骨片をハサミで切り取ります。
骨片のあるフィルターを50ミリリットルのチューブに置き、メスでフィルターを開きます。ピンセットで、骨画分を5ミリリットルのマウスB&M解離ミックスに移します。次に、チューブを摂氏37度のウォーターバスに水平に置き、120RPMを30分間振とうします。
消化後、0.5%BSAと2ミリモルEDTAを含む25ミリリットルのM199培地を追加します。間質細胞を含む上清を70ミクロンの細胞ストレーナーでろ過し、冷たい50ミリリットルのチューブに入れます。
