生きているトリパノソーマ・ブルーセイのグリコソームの相対pHを測定するためのフローサイトメトリー手順

まず、フローサイトメーターソフトウェアを起動します。新しいテストを開きます。必要な数のサンプルを追加し、名前を付けます。

次に、YL2-HまたはRL1-Hチャンネルヒストグラム、前方散乱面積対側方散乱面積のドットプロット、前方散乱面積対前方散乱高さのドットプロット、BL1-HとVL2-Hのチャンネルドットプロットを設定します。未染色の野生型Trypanosoma bruceiコントロール細胞をサンプル注入ポートにセットし、ステージ位置を調整します。ファイルサイズを小さくするには、録音を意図していないチャンネルのチェックを外します。

調整を可能にするために、低流量から開始します。次に、[実行]をクリックしてデータ取得を開始します。YL2またはRL1の電圧を微調整して、10〜3〜10〜4番目の相対蛍光強度単位内のメインピークを揃えます。

前方散乱光と側方散乱の電圧を調整して、イベントの90%以上がドットプロット範囲内にあるようにします。前方散乱閾値を設定して、生細胞を省略せずにデブリを除外します。VL 2 および BL 1 チャンネル設定を変更して、未染色野生型コントロールの一次ピークを 10 から 2 から 10 から 4 番目の相対蛍光強度単位以内に配置します。

[記録] をクリックし、少なくとも 10, 000 のイベントを測定します。次に、ヨウ化プロピジウムまたはチアゾールレッドで染色した最初の誘導pHluorin発現トリパノソーマサンプルをサンプル注入ポートに配置します。ここでも、すすぎを行った後、低流量でデータ取得を開始してください。

各プロットを監視して、90%を超えるイベントが正しくキャプチャされ、VL2-HチャネルとBL1-Hチャネルが飽和していないことを確認します。各サンプルのデータをFCSファイル形式で保存し、分析の準備をします。