卵巣癌オルガノイド培養の確立とその評価

まず、分離したばかりの卵巣がん組織を採取します。カルシウムとマグネシウムを含まないPBSを使用して、ペトリ皿で新鮮な組織を完全に洗浄します。使い捨てのメスとハサミを使用して、ペトリ皿の組織を細かく砕きます。

極低温チューブに組織を採取します。次に、これらのチューブを液体窒素で満たされた容器に移し、衝撃凍結します。次に、2〜3ミリメートルの組織を組織学的標本容器に採取し、ホルマリン容器に24時間固定します。

酵素消化の前にメスを使用して組織を均質化し、機械的解離を最大化します。その後、摂氏37度のウォーターバスで1.5時間インキュベートします。インキュベーション後、15ミリリットルの冷たい基礎培地をチューブに導入します。

チューブを300Gで5分間遠心分離し、上清を取り除き、5ミリリットルの新しい基礎培地を加えます。次に、400マイクロメートルのフィルターを使用して細胞懸濁液を新しい15ミリリットルのチューブに濾します。赤血球を除去するには、5ミリリットルの赤血球溶解バッファーを細胞ペレットに添加し、摂氏37度のウォーターバスで5分間インキュベートします。

インキュベーション後、溶解不活性化のために5ミリリットルの基礎培地を添加します。遠心分離により細胞をペレット化し、細胞ペレットに3ミリリットルの基礎培地を添加します。次に、基礎培養培地に懸濁した必要な数の細胞を新しいチューブに移します。

細胞を遠心分離し、上清を廃棄した後、細胞ペレットを冷たいBME2マトリックスと氷上で完全に混合します。細胞をBME 2マトリックスの液滴に播種し、その間にピペッティングしながら、均一に分散させます。次に、各卵巣がん培地250マイクロリットルを対応するウェルに加えます。

残りの単離細胞から2D培養を開始するには、細胞を300Gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを2D培地に添加します。位相差顕微鏡を使用して、2D培養と3D培養の両方の高品質画像、および直接観察プレートを使用します。ウェルの概要を示すために4倍対物レンズでプレートを画像化し、オルガノイド形態を記録するために10倍対物レンズと20倍対物レンズでプレートを画像化します。

個々の行専用のフォルダーに画像を整理して保存します。単離後約14〜21日で、量、サイズ、細胞表現型などのオルガノイド形成能を評価します。液胞の欠如、膜の破裂、接着の喪失、細胞の切り上げなどの特定の特徴を探します。

オルガノイド株は、原発性高悪性度漿液性、ネオアジュバント後インターバル手術、再発性疾患など、さまざまな組織型および病期から正常に作製されました。