1安楽死させたマウスからscBAT 2を解剖した後、 3 すぐに組織をマイクロ遠心チューブに入れます。 4 滅菌針でチューブの上部に穴を開けます 5 液体窒素で凍結します。 6 乳棒と細いヘラを液体窒素に浸します。
7 スナップ凍結組織サンプル8をマイクロ遠心チューブから乳鉢に注ぎます。9乳鉢10に少量の液体窒素を加え、完全に粉砕されるまで乳棒11で組織を完全に粉砕します。12細いヘラを使用して、粉砕された組織をこすり落とし、13をマイクロ遠心チューブに戻します。
14すべての組織が移植されたら、15チューブ16に500マイクロリットルのRNA単離溶液を加え、ペレット乳棒モーターを使用して30秒間超音波処理する。17次に、注射器を使用して10倍18を上下にピペットで動かし、組織をさらにシラミを取り除き、19固体粒子が見えないようにします。20 5分間の室温インキュベーション中に、250マイクロリットルのクロロホルムとボルテックスを時々加えます。
22 21, 000 Gでサンプルを20分間遠心分離します。24上部の水性層を新しいチューブに移し、25、等量の70%エタノールを追加します。26 500マイクロリットルのライセート27を結合カラムに移す。
28 18, 000 Gで60秒間遠心分離し、29濾液を廃棄します。30 逆転写のために、DEPC処理水で希釈したRNA1マイクログラム31をPCRチューブストリップに0.5から1μg加える。32次に、DEPC処理水を使用してCDNAをマイクロリットルあたり250ナノグラム33に希釈し、定量的PCRを設定します。
34 scBAT機能の媒介に関与するマーカー遺伝子35の発現レベルは、scBATと肩甲骨間コウモリの間で比較的類似していた36。
