まず、神経堤誘導を受けたヒト多能性幹細胞を12日間培養します。細胞から培地Cを穏やかに吸引します。ウェル表面積1平方センチメートルあたり100マイクロリットルのPBSを加えて細胞を洗浄し、PBSを除去します。
等量の細胞剥離溶液を細胞に加え、5%二酸化炭素を37°Cで添加して30分間インキュベートします。等量のNCCメディウムをプレートに加えます。次に、血清学的ピペットを使用して細胞懸濁液を回収し、15ミリリットルの円錐管に移します。
細胞を290Gで20〜25°Cの間で2分間回転させます。細胞ペレットを乱さないように、上清を慎重に廃棄します。10ミリリットルの血清ピペットを使用して、12ミリリットルのNCC培地を細胞ペレットにピペットで注入します。
サスペンションを機械的に上下にピペットで動かしてサスペンションを作成します。次に、細胞懸濁液を超低接着プレートに移します。14日目に、細胞培養プレートを静かに渦巻いて、各ウェルの中央に小さなスフェロイドを集めます。
P1000マイクロピペットを使用して、各ウェルの周囲から使用済み培地をゆっくりと吸引します。元の容量のNCC培地をセルに再度供給します。15日目に、培地を慎重に取り出します。
PBSをウェルに追加して、スフェロイドを洗浄します。次に、PBSをできるだけ取り除き、スフェロイドが乱されないようにします。次に、ウェル表面積1平方センチメートルあたり100マイクロリットルの細胞剥離溶液を添加します。
溶液中の細胞を5%二酸化炭素下、摂氏37度で30分間インキュベートします。10ミリリットルの血清ピペットを使用して、各ウェルに等量のENC培地を加えます。溶液を機械的にピペットで動かして、残っているスフェロイドを切断します。
次に、細胞を50ミリリットルの円錐管に移します。以前と同様に遠心分離した後、上清を捨ててください。次に、細胞を5〜10ミリリットルのENC培地に再懸濁します。
トリパンブルーと血球計算盤を使用して生細胞の濃度をカウントします。次に、表面積の平方センチメートルあたり約300、000〜400、000の生存細胞、およびミリリットルあたり約100万個の細胞の密度をプレートに十分な量のENC培地を追加します。次に、ウェルから溶液を吸引します。
次に、PO/FNラミニンコーティングウェルを装着したプレートに細胞を添加します。30〜40日目まで、ウェル表面積1平方センチメートルあたり200マイクロリットルのENC培地を隔日で細胞に供給します。神経堤誘導後に、滑らかな表面を持つ高品質の自由浮遊球が観察されました。
スフェロイドは神経堤マーカーSOX10を発現した。神経突起は、腸管ニューロン誘導中の25日目から30日目の間に観察されました。
