ジャガイモのデキストロースオーガース傾斜で30°Cで6日間、無酸素原性のAspergillus flavus NRRL 3357を成長させた後、試験管からTween 20を含む10ミリリットルの水で真菌胞子を溶出します。試験管を20秒間ボルテックスします。漏斗に入れたグラスウールで真菌胞子懸濁液をろ過し、渦巻き状の濾液を使用して希釈します。
ろ過した懸濁液の100マイクロリットルのアリコートを9.9ミリリットルの水で希釈します。.ボルテックス後、血球計算盤で胞子を数えます。画面上の式を使用して、元の懸濁液の1体積を傾斜から1マイクロリットルあたり1000胞子に希釈するために必要な水の量を計算します。
計算された水の量に元の懸濁液の1体積を追加します。次に、ピーナッツのさやをそっと割って、外皮を取り出します。種子を滅菌ビーカーに入れます。
ビーカーが70%満たされるまで0.05%の過酸化水素溶液を加え、種子が3時間水を吸収できるようにします。種子から過酸化水素溶液をデカントし、80%エタノール水混合物の約3倍の量を加えて種子を覆います。1分間インキュベートします。
次に、等量の滅菌蒸留水で種子を2回すすぎます。ビーカーに5倍の容量の3%過酸化水素溶液を加え、5分間放置します。過酸化水素溶液をデカントした後、等量の滅菌水で種子を2回すすいでください。
蓋に直径90mmの濾紙を入れ、1ミリリットルの滅菌水で湿らせます。皿に蓋をします。滅菌ペーパータオルの上に種を置きます。
鉗子を使用して、種子の皮を取り除きます。脱水症状を避けるために、皮を剥いた種子をすぐにペトリ皿に入れます。胚軸を含む種子の約3分の1を切り取ります。
種子を子葉に分け、鋭利なドリルビットを使用して、各子葉の外側の中央に約1.5〜2ミリメートルの深さでドリルします。1.5%オーガー皿に4〜6個の穴を開けた種子を置きます。10マイクロリットルのピペットを使用して、各半分の子葉片の穴あけ空洞に2マイクロリットルの胞子懸濁液を追加します。
皿を蓋で覆った後、光なしで摂氏30度で72時間インキュベートします。
