まず、HEK 293細胞の培養に必要なすべての材料を清潔なバイオセーフティフードに入れます。解凍後、HEK 293細胞懸濁液をバイアルから50ミリリットルチューブ中の30ミリリットルの予熱した浮遊細胞培地に移します。細胞を摂氏37度、湿度80%、二酸化炭素8%、200RPMで3〜4日間インキュベートします。
400マイクロリットルの0.4%トリパンブルー溶液に100マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、チューブを静かに反転させて混合します。50マイクロリットルのトリパンブルー処理細胞懸濁液を血球計算盤に置き、総生細胞数をスライドさせ、トランスフェクションに必要な細胞懸濁液の量を計算します。予熱した懸濁液細胞培地に必要量の細胞懸濁液を加え、8%二酸化炭素と摂氏37度でインキュベートします。
1ミリリットルあたり100万個の細胞を300ミリリットルの浮遊細胞培地にHEK 293細胞懸濁液を加え、8%の二酸化炭素と摂氏37度でインキュベートします。2日目に、浮遊細胞培地、プラスミド、トランスフェクション試薬を室温に温めます。調製した培地にプラスミドを添加して短時間ボルテックスした後、トランスフェクション試薬を添加し、再度ボルテックスを短時間加えてから、室温で30分間インキュベートします。
トランスフェクションミックスのインキュベーション中に、1日目に培養した細胞をカウントし、必要に応じて、細胞密度を1ミリリットルあたり200万〜250万細胞の間で調整します。30分後、滴下し、チューブを静かに旋回させながらトランスフェクション混合物を細胞に添加し、72〜96時間インキュベートします。5日目に、33 mLの10x Cell Lysis Bufferを細胞に加え、穏やかに振とうして混合します。
懸濁液を摂氏37度で1.5時間、振とうしながらインキュベートします。細胞懸濁液を3, 428 G、摂氏4度で60分間遠心分離します。上清を0.45ミクロンのPES真空フィルターでろ過し、清澄化したライセートをフィルター容器に回収します。
ろ過された細胞のライセートの360ミリリットルに40%PEG 8、000の解決の90ミリリットルを加えなさい。70%エタノール滅菌攪拌子を細胞ライセートに加え、氷上または冷蔵室で300RPMで1時間撹拌した後、攪拌せずに摂氏4度で一晩インキュベートします。
