経験依存性の臨界期シナプス糸球体刈り込みを解析するための共焦点イメージングとシナプス測定

まず、スライドを取り、それに両面粘着テープの薄いストリップを2つ追加して、イメージングの準備をします。脳の取り付けのために、2つのテープの間に約10〜15マイクロリットルの封入媒体をピペットで固定します。PBSと0.2%Triton X-100を事前にすすぎたP20ピペットチップを備えた顕微鏡スライドに、ラベルのショウジョウバエの脳を移します。

脳が移されたら、細い絵筆を使用して脳を位置合わせし、触角葉が上を向くようにします。脳の向きを整えた後、ガラスのカバースリップで脳を覆います。次に、カバースリップの側面に追加の封入剤を充填します。

カバースリップの端を透明なマニキュアで密封します。スライドを完全に乾燥させた後、その後のイメージングのために冷蔵庫に保管してください。イメージングには、63X油浸対物レンズを装備したレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用します。

アルゴン488とヘリウムネオン543レーザーを使用して、触角葉のシナプス糸球体とOr42a嗅覚ニューロンをイメージングします。両方のチャネルの光学ゲインとオフセットを求めます。イメージングを脳の中心に置き、VM7糸球体に焦点を合わせます。

脳の真ん中の穴にほぼ位置を特定します。1024 x 1024の画像解像度を選択します。触角ローブを通して共焦点Zスタックプロジェクション全体をキャプチャーし、VM7糸球体のOr42aニューロン神経支配全体がキャプチャーされるようにします。

遺伝子型または条件盲検画像をフィジーに読み込みます。レーザーラインチャンネルを分割するには、画像に移動し、[色]をクリックして、分割チャンネルを選択します。Or42a嗅覚チャネルで、Zスタックをスクロールして、Or42aニューロン神経支配を含むスライスを特定し、蛍光の開始と終了を特定します。

Or42a ニューロン神経支配のスライスのみを含む合計スライス投影を作成するには、画像をクリックしてスタックに移動します。次に、[Z プロジェクト] をクリックし、合計スライスを選択して、目的の範囲を入力します。フィジーのなげなわツールを使用して、VM7糸球体内のOr42aニューロン神経支配の輪郭をトレースします。

トレースした領域の円周にZスタックスライスの数と各スライスの厚さを掛けて、VM7シナプス糸球体神経支配ボリュームを計算します。制御臭気ビヒクルに24時間曝露した後、密集したOr42a MCD:GFP神経支配が両方の触角葉のVM7糸球体に持続します。対照的に、25%EBの臭気物質に24時間さらされると、著しい剪定とシナプス糸球体容積の喪失を引き起こします。

EB臭気物質濃度が増加すると、シナプス糸球体の剪定が徐々に大きくなります。この範囲のEB臭気物質濃度の代表的な定量では、蛍光強度と神経支配量について同様の結果が示されました。