まず、2ミリリットルのマイクロ遠心チューブにラベルを付けます。大腸菌DnaK756培養物の50マイクロリットルアリコートをチューブにピペットで移します。チューブを氷の上に置きます。
10〜50ナノグラムのプラスミドDNAを、大腸菌アリコートを含む各チューブに追加します。チューブを氷上に30分間保管します。次に、セルを摂氏42度で60秒間置き、セルにヒートショックを与えます。
チューブを氷に10分間戻します。950マイクロリットルの新鮮な酵母トリプトンブロスをチューブにピペットで移し、摂氏37度のシェーカーでチューブをインキュベートします。形質転換した細胞培養液100マイクロリットルをピペットで移し、抗生物質を含む酵母トリプトンを2倍添加した寒天プレートに広げます。
残りの細胞を摂氏4度で5, 000Gで1分間遠心分離します。約800マイクロリットルのスープをデカントします。ペレット化した細胞を残りの培地に再懸濁します。
回収した細胞を2倍酵母トリプトン寒天プレートに播種し、両方の寒天プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。細胞をプレーティングするには、滅菌ループを使用して形質転換体から単一のコロニーをピックアップします。抗生物質を補給した2倍酵母トリプトンブロス10ミリリットルに接種します。
次に、2ミリリットルのマイクロ遠心チューブで100から10からマイナス5分の1までの細胞の連続希釈液を調製します。細胞を見つける前に、抗生物質とIPTGを添加した寒天プレートを、蓋を部分的に開いた状態で摂氏40度のオーブンに入れます。プレートが十分に乾いたら、段階希釈した細胞を2マイクロリットル寒天プレートにスポットします。
各サンプルを 2 つの別々のプレートにスポットします。一方のプレートを許容増殖温度37°Cでインキュベートし、もう一方のプレートを非許容増殖温度(摂氏43.5°C)でインキュベートします。組換えタンパク質の発現を確認するには、滅菌ループを使用して、形質転換体の同じコロニーから残りの細胞の一部をピックアップします。
細胞を10ミリリットルの抗生物質添加酵母トリプトンブロスに接種します。培養物をシェーカーで摂氏37度で一晩インキュベートします。すべての大腸菌DnaK756細胞は、摂氏37度の許容増殖温度で増殖しました。
しかし、DnaKとKPfを発現する異種細胞のみが非許容増殖温度で増殖した。KPf-V436Fを発現する変異細胞は、摂氏37度でしか増殖しなかったが、摂氏43.5度では増殖しなかった。
