SDS PAGEを用いたHsp70シャペロン活性の解析と形質転換 大腸菌 タンパク質のウェスタンブロット解析

まず、80マイクロリットルの形質転換大腸菌細胞をバイアルにピペットで移します。20マイクロリットルの4倍のLaemmli SDSローディングバッファーをバイアルにピペットで移します。懸濁液を加熱ブロックで摂氏100度で10分間沸騰させます。

次に、10マイクロリットルのサンプルをプレキャストSDSゲルにロードします。ゲルを室温で120ボルト、SDSランニングバッファー中で1時間電気泳動します。電気泳動が完了したら、ゲルをクマシー染色で1時間染色します。

蒸留水に溶かした50%メタノールと10%酢酸を含む脱色バッファー中でゲルを2時間脱色します。ゲルをゲルイメージングシステムに入れて、タンパク質バンドを可視化します。次に、SDSゲルのタンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写します。

ニトロセルロースメンブレンを洗浄バッファーで3回洗浄します。1対2、000の比率に希釈された抗体を含む5%の脱脂乳に膜を移します。メンブレンを抗体と摂氏4度でインキュベートし、60RPMで1時間振とうします。

次に、ニトロセルロースメンブレンをTBSトゥイーンバッファーでそれぞれ15分間、3回洗浄して、非特異的結合抗体を除去します。次に、メンブレンを二次抗体の入ったディッシュに移します。メンブレンを摂氏4度でインキュベートし、60RPMで1時間振とうします。

前と同じようにメンブレンを洗浄した後、強化された化学発光検出試薬を使用してバンドを分離します。ゲルイメージャーを使用してバンドを可視化します。